Иммунофлуоресцентное окрашивание, конфокальная визуализация и 3D-реконструкция синоатриального и атриовентрикулярного узла у мыши

Резюме

Мы предоставляем пошаговый протокол для иммунофлуоресцентного окрашивания синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) в сердцах мышей.

Аннотация

Электрический сигнал, физиологически генерируемый клетками кардиостимулятора в синоатриальном узле (SAN), проводится через проводящую систему, которая включает в себя атриовентрикулярный узел (AVN), чтобы обеспечить возбуждение и сокращение всего сердца. Любая дисфункция SAN или AVN приводит к аритмиям, что указывает на их фундаментальную роль в электрофизиологии и аритмогенезе. Мышиные модели широко используются в исследованиях аритмии, но конкретное исследование SAN и AVN остается сложным.

SAN расположен на стыке crista terminalis с верхней полой веной, а AVN расположен на вершине треугольника Коха, образованного отверстием коронарного синуса, трикуспидальным кольцом и сухожилием Тодаро. Однако из-за небольших размеров визуализация с помощью обычной гистологии остается сложной задачей и не позволяет изучать SAN и AVN в их 3D-среде.

Здесь мы описываем цельномонтный иммунофлуоресцентный подход, который позволяет локально визуализировать меченые мыши SAN и AVN. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание предназначено для небольших участков ткани без необходимости ручного сечения. С этой целью сердце мыши рассекают, удаляют нежелательные ткани с последующей фиксацией, пермеабилизацией и блокировкой. Затем клетки проводящей системы внутри SAN и AVN окрашивают антителом против HCN4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и обработка изображений позволяют дифференцировать узловые клетки и работающие кардиомиоциты, а также четко локализовать SAN и AVN. Кроме того, дополнительные антитела могут быть объединены для маркировки других типов клеток, таких как нервные волокна.

По сравнению с традиционной иммуногистологией, полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание сохраняет анатомическую целостность сердечной проводящей системы, что позволяет исследовать AVN; особенно в их анатомии и взаимодействиях с окружающими рабочими клетками миокарда и немиоцитарными клетками.

Введение

Аритмии являются распространенными заболеваниями, поражающими миллионы людей, и являются причиной значительной заболеваемости и смертности во всем мире. Несмотря на огромные успехи в лечении и профилактике, такие как разработка кардиостимуляторов, лечение аритмий остается сложным, в первую очередь из-за очень ограниченных знаний о механизмах основного заболевания ^1,2,3. Лучшее понимание как нормальной электрофизиологии, так и патофизиологии аритмий может помочь разработать новые, инновационные и причинно-следственные стратегии лечения в будущем. Кроме того, для всестороннего изучения аритмогенеза важно локализовать и визуализировать конкретную систему сердечной проводимости на животных моделях, таких как мыши, поскольку мыши широко используются в электрофизиологических исследованиях.

Основными частями системы сердечной проводимости являются синоатриальный узел (SAN), где электрический импульс генерируется в специализированных клетках кардиостимулятора, и атриовентрикулярный узел (AVN), который является единственным электрическим соединением между предсердиями и желудочками⁴. Всякий раз, когда электрофизиологические свойства SAN и AVN изменяются, могут возникать аритмии, такие как синдром больного синуса или атриовентрикулярная блокада, которые могут привести к ухудшению гемодинамики, обмороку и даже смерти, и, таким образом, подчеркнуть существенную роль как SAN, так и AVN в электрофизиологии и аритмогенезе⁵.

Комплексные исследования SAN или AVN требуют точной локализации и визуализации обеих структур, в идеале в их физиологической среде. Однако из-за их небольших размеров и расположения в пределах рабочего миокарда, без установления четкой макроскопически видимой структуры, изучение анатомии и электрофизиологии SAN и AVN является сложной задачей. Анатомические ориентиры могут быть использованы для приблизительной идентификации области, содержащей SAN и AVN ^6,7,8. Короче говоря, SAN расположен в межкавалевой области правого предсердия, прилегающей к мышечной crista terminalis (CT), AVN расположен в треугольнике Коха, установленном трикуспидальным клапаном, остиумом коронарного синуса и сухожилием Тодаро. До сих пор эти анатомические ориентиры в основном использовались для локализации, удаления, а затем изучения SAN и AVN как отдельных структур (например, с помощью обычной гистологии). Однако для лучшего понимания сложной электрофизиологии SAN и AVN (например, регуляторных эффектов соседних клеток рабочего миокарда) необходимо изучение проводящих систем в физиологической 3D-среде.

Полноуровневое иммунофлуоресцентное окрашивание представляет собой метод, который используется для изучения анатомических структур in situ при сохранении целостности окружающих тканей⁹. Используя преимущества конфокальной микроскопии и программного обеспечения для анализа изображений, SAN и AVN могут быть визуализированы с флуоресцентно мечеными антителами, нацеленными на ионные каналы, специально выраженные в этих областях.

Этот следующий протокол объясняет необходимые шаги для выполнения хорошо зарекомендовавшего себя метода окрашивания цельным креплением для локализации и визуализации микроскопов SAN и AVN. В частности, этот протокол описывает, как (1) локализовать SAN и AVN анатомическими ориентирами для подготовки этих образцов к окрашиванию и микроскопическому анализу (2) выполнить полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание эталонных маркеров HCN4 и Cx43 (3) для подготовки образцов SAN и AVN для конфокальной микроскопии (4) для выполнения конфокальной визуализации SAN и AVN. Мы также описываем, как этот протокол может быть модифицирован, чтобы включить дополнительное окрашивание окружающего рабочего миокарда или немиоцитарных клеток, таких как автономные нервные волокна, что позволяет тщательно исследовать систему сердечной проводимости в сердце.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета, а все процедуры, проводимые на мышах, были одобрены правительством Баварии, Мюнхен, Германия (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Мыши C57BL6/J были приобретены в лаборатории Джексона.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны инструменты, необходимые для эксперимента. На рисунке 2 показана иллюстрация грубой анатомии сердца. На рисунке 3 показано расположение SAN и AVN в сердце взрослой мыши. На рисунке 4 показан подготовленный образец, загруженный на конфокальную микроскопию.

1. Препараты

1. Готовят 4% раствор формальдегида (4% PFA) путем разбавления 10 мл 16% раствора формальдегида в 30 мл PBS.
2. Готовят 15% раствор сахарозы и 30% раствор сахарозы, растворяя 15 г и 30 г порошка сахарозы в 100 мл PBS соответственно. После того, как порошок сахарозы полностью растворен, процедите раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм перед хранением при 4 °C.
3. Приготовьте 3%-4% агарозный гель, добавьте 3 г или 4 г порошка агарозы и 100 мл 1x TAE (разбавленного из 50x TAE стокового раствора) в стакан. Поместите стакан на магнитную мешалку и кипятите до полного растворения агарозы.
4. Приготовить форму для рассечения, аккуратно влив 30 мл агарозного геля (3%-4%) в чашку Петри диаметром 100 мм. Оставьте чашку Петри на скамейке при комнатной температуре, чтобы она остыла и затвердела.
5. Готовят блокирующий раствор и моющий раствор по рецептам, приведенным в таблице 1. Подготовьте все растворы, приготовленные в день использования. Длительное хранение не рекомендуется.
6. Подготовьте растворы антител, разбавляя их в холодном (4 °C) 1x PBS, защитите разбавление от света (например, обернув алюминиевую фольгу вокруг) и держите разведения на льду до использования. Разбавляют антитела незадолго до инкубации. Избегайте оставления разбавленных антител при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующее разведение антител должно быть протестировано с сопоставимыми образцами тканей путем выполнения обычного иммунофлуоресцентного окрашивания. Здесь мы проверили антитела, окрашивая замороженные участки, разрезанные толщиной 10 мкм.

2. Извлечение органов и подготовка тканей

1. Обезболивают мышь, помещая ее в инкубационную камеру, подключенную к испарителюру изофлурана. Установите испаритель для подачи 4-5% изофлурана (96-95% кислорода соответственно).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полная анестезия подтверждается потерей постуральной реакции и корректирующего рефлекса путем осторожного перекатывания камеры до тех пор, пока мышь не будет помещена на спину.
2. Поставьте мышь в лежачее положение на хирургическом столе. Поместите нос мыши в анестезиологическую маску, соединенную с модифицированной цепью Bain с внутренней трубкой, соединенной с испарителем изофлурана. Для поддержания анестезии используют 1-2% изофлуран в кислороде со скоростью потока 1 л/мин. Удалите лишние пары анестетика от мыши через внешнюю трубку маски и вытяните через канистру активированного угля, который поглощает избыток анестезирующего газа.
3. При достижении полной анестезии вводят фентанил для обезболивания (0,1 μг/25 г массы тела в/.).
4. Когда рефлекс защемления пальца ноги не обнаруживается, сделайте четкий разрез от югула до симфиза, используя ножницы для радужной оболочки для удаления меха и кожи. Сделайте еще один разрез слева направо под ребрами, используя ножницы радужной оболочки, чтобы осторожно открыть живот.
5. Оживить меченого немного с помощью изогнутых щипцов, позволяющих разрезать диафрагму слева направо, не травмируя никаких органов. Разрежьте грудную клетку медиальной подмышечной линией с обеих сторон, используя ножницы для радужной оболочки глаза, чтобы перевернуть ее краниально и обеспечить доступ к сердцу.
6. Разрезать нижнюю полую вену и нисходящую грудную аорту на уровне диафрагмы с помощью ножниц радужной оболочки. Проколите сердце иглой 27 G в области вершины, а затем осторожно протолкните иглу в левый желудочек (LV). Осторожно введите 5-10 мл ледяного PBS в LV для перфузии сердца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет сердца должен превратиться из красного в серый, что указывает на успешную перфузию PBS.
7. Осторожно поднимите верхушку сердца с помощью пинцета, позволяющего перерезать крупные сосуды и удалить сердце.
8. Иссекайте сердце, разрезая крупные артерии и вены как можно дальше от сердца, чтобы избежать любого повреждения верхней полой вены (SVC). Сохраните SVC, так как он будет служить важным ориентиром во время последующей обработки.
9. После удаления сердца выключите испаритель изофлурана.
10. Поместите сердце в тарелку для рассечения, наполненную ледяным холодом PBS под рассекающим микроскопом. После определения левой/правой и передней/задней части сердца поверните сердце передней частью сердца на дне тарелки (обнажите крупные сосуды, расположенные сзади).
11. Обездвижить сердце, вставив маленькую зажимку верхушки и придатка левого предсердия (LAA) в агарозу в нижней части тарелки для рассечения (рисунок 2A). Используя тонкий пинцет и ножницы, осторожно удалите несердечную ткань вокруг SVC и нижней полой вены (IVC) (например, легкие, жир, перикард), чтобы обнажить межкаваловую область (рисунок 3A).
12. Удалите большинство желудочков, разрезав параллельно канавку между желудочками и предсердиями с помощью микроножек. Сохранить небольшую часть желудочковой ткани для последующей нагрузки на оргстекловое кольцо.
13. Для фиксации и обезвоживания поместите образец (содержащий предсердия, SVC и IVC) в 4% PFA на ночь при 4 °C.
14. На следующий день переводят сердце на 15% раствор сахарозы в течение 24 часов при 4 °C.
15. На следующий день переводят сердце на 30% раствор сахарозы в течение 24 часов при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации и обезвоживания на этапах 2.13, 2.14 и 2.15 образцы оставляют при 4°С без дальнейшего перемешивания или раскачивания.

3. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Промыть сердце в 1% Тритоне Х-100, разведенном в PBS и блокировать и пермеабилизировать в блокирующем растворе (таблица 1) на ночь при 4 °C.
2. Поместите сердце в пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте с антимышевым коннексином-43 кролика (разведение 1:200) и крысиным антимышевым HCN4 (разведение 1:200) антителами, разбавленными блокирующим раствором в течение 7 дней при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация первичных антител должна быть проверена перед использованием технических описаний в качестве ориентира. Другие антигены, представляющие интерес, также могут быть окрашены на этом этапе, если вид хозяина первичного антигена отличается от других. Более высокая концентрация тритона X-100 может помочь получить более эффективное окрашивание антителами, как это было продемонстрировано до¹⁰, но концентрация может быть определена индивидуально.
3. Через 7 дней удаляют раствор, содержащий первичные антитела, с помощью пипетки и промывают сердце 1%-ным раствором Тритона Х-100 3 раза (каждый раз в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере).
4. После промывания инкубируйте сердце = с Alexa Fluor 488 козьим анти-крысиным IgG (разведение 1:200) и Alexa Fluor 647 козьим анти-кроликом IgG (разведение 1:200) в течение 7 дней при 4 °C.
5. Через 7 дней удалите весь раствор, содержащий вторичные антитела, с помощью пипетки. Затем промыть сердце с помощью промывочного раствора (табл. 1) 3 раза (каждый раз в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере).
6. Для окрашивания ядер инкубируют сердце в растворе DAPI (10 мкг/мл) в течение ночи при 4 °C.
7. На следующий день промыть сердце моющим раствором 3 раза (каждый раз в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для блокирования, пермеабилизации, инкубации антител и окрашивания DAPI на этапах 3.1, 3.2, 3.4 и 3.6 оставьте образцы в установившемся состоянии при температуре 4°C, перемешивание не требуется. Окрашенная ткань может быть сохранена полностью покрыта моющим раствором при 4 °C и защищена от света в течение нескольких дней до визуализации в конфокальном микроскопе.

4. Конфокальная микроскопия

1. Подготовьте кольца из оргстекла и заполните пластилином (рисунок 1). В центре пластилина образуется небольшая канавка для нагрузки на сердце. Сделайте неглубокую канавку, так как для этого было бы легче получить плоскую плоскость визуализации, а также отрегулировать пространство и избежать пузырьков воздуха между образцом и крышками на этапе 4.4.
2. Используйте один и тот же образец сердца для визуализации как SAN, так и AVN последовательно. Для визуализации SAN непосредственно нагружайте сердце, тогда как для визуализации AVN выполняйте микродиссекцию раньше.
   1. Создание образов SAN
      1. Идентифицируют SAN по анатомическим ориентирам: он расположен на спинной стороне сердца в пределах межкавалесной области (область между верхней и нижней полой веной). Crista terminalis (CT) - это мышечная полоса между SAN и RAA.
      2. Поместите сердце в пластилиновую бороздку спинкой сердца вверх. Добавьте PBS на сердце, чтобы вытеснить весь воздух в полости, пока сердце не будет полностью покрыто PBS (обычно достаточно нескольких капель PBS).
      3. Под рассеченным микроскопом осторожно вдавите RAA, LAA и оставшиеся части левого желудочка в пластилин, чтобы зафиксировать сердце. Убедитесь, что вся межкваковая область и crista terminalis хорошо видны (не покрыты пластилином). Область, которая будет изображена, показана на рисунке 3A.
   2. AvN-визуализация
      1. После завершения визуализации SAN вспомните тот же образец и впоследствии используйте для визуализации AVN. Для микродиссекции AVN поместите сердце = на диссекционную чашку под рассеченным микроскопом.
      2. Ориентируйте сердце правой стороной вверх (включая оставшиеся части правого желудочка). Пропустите штифты через оставшуюся часть свободной стенки LV (которая теперь находится внизу), чтобы обездвижить ткань (рисунок 2B).
      3. Отрежьте оставшуюся свободную стенку RV вверх через трикуспидальный клапан и верхнюю полую вену. Затем отбросьте RV и RA, чтобы обнажить межжелудочковую и межатриальную перегородку. (Рисунок 3B)
         ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на то, чтобы не повредить коронарный синус (CS), так как это важный анатомический ориентир, чтобы найти треугольник Коха, который затем позволяет локализовать AVN. CS проходит поперечно в левой атриовентрикулярной бороздке на задней стороне сердца, а отверстие отверстия CS расположено между IVC и трехстворчатым клапаном в нижней части межпредсердной перегородки (рисунок 3A и B).
      4. Определите треугольник Коха, который можно найти на эндокардиальной поверхности правого предсердия, окаймленный спереди шарнирной линией перегородчатого листка трикуспидального клапана (ТВ), а сзади сухожилием Тодаро. Основание образовано отверстием коронарного синуса (рисунок 3В). Поскольку это целевая область для визуализации AVN, она должна быть четко видна.
      5. Переместите сердце в пластилиновую канавку внутри плексигласового кольца с треугольником Коха, четко обнаженным (т.е. не покрытым пластилином). Осторожно вдавите ткань вокруг треугольника Коха в пластилин, чтобы зафиксировать образец. Добавьте PBS на сердце, чтобы вытеснить весь воздух в полости, пока сердце не будет полностью покрыто PBS (обычно достаточно нескольких капель PBS).
3. Нанесите силикон на края колец из оргстекла, чтобы можно было покрыть сердца, загруженные в заполненные пластилином кольца из плексигласа, крышками.
4. Осторожно надавите на заднюю сторону пластилина, чтобы выдавить части PBS и прикрепить сердце к крышке, избегая при этом пузырьков воздуха в области визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что интересующие области не сложены и закрыты во время нажатия на заднюю сторону пластилина. Плоская плоскость визуализации без избыточного сжатия образца необходима для сохранения анатомии и для правильной конфокальной визуализации образцов. Для SAN важно убедиться, что межкавалическая область четко открыта. Для AVN треугольник Коха должен быть полностью открыт.
5. Поместите образцы окрашивания всего крепления вверх ногами на платформу конфокального микроскопа. Открытый SAN/AVN, прикрепленный к крышке, теперь находится на нижней части платформы микроскопа (рисунок 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения снимков мы используем Carl Zeiss LSM800 с airyscan Unit и программным обеспечением ZEN 2.3 SP1 черного цвета.
6. Выбирайте пластину "BP420-480 + LP605" для возбуждения Alexa Fluor 647 конъюгированного анти-HCN4. Варьируйте коэффициент усиления мастера от 650-750.
7. Сделайте обзорное изображение всей области SAN и AVN с помощью функции сканирования плитки . Затем выберите HCN4-положительную область, щелкнув и добавив квадрат на обзорное изображение вокруг интересующей области, которая будет сканироваться.
8. Проверьте параметры, включая пластины и коэффициент усиления для остальных каналов (Alexa Fluor 488 и DAPI) конфокального микроскопа и установите, как описано в шаге 4.6.
9. Медленно настройте фокус сверху вниз образца, чтобы просмотреть весь образец и установить Первый и Последний для диапазона Z-стека. Установите оптимальный интервал для Z-стека на основе толщины оптического образца. Мы используем объектив 20x и 0,8-1 мкм в качестве интервала для Z-стека.
10. После того, как все параметры правильно установлены, просканируйте всю область SAN и AVN.
11. Выполняйте 3D-реконструкцию изображений с помощью программного обеспечения (например, Imaris версии 8.4.2).
    1. Выберите обработку изображений | Базовое вычитание для удаления фонового окрашивания.
    2. Выберите создание поверхности в настройках для выбранного канала и области, представляющей интерес для обработки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя протокол, описанный выше, можно надежно выполнить конфокальную микроскопическую визуализацию как SAN, так и AVN. Специфическое окрашивание проводящей системы с использованием флуоресцентных антител, нацеленных на HCN4, и окрашивание рабочего миокарда с использ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Анатомия сердца традиционно изучается с использованием тонких гистологических срезов¹¹. Однако эти методы не сохраняют трехмерную структуру проводящей системы и, таким образом, предоставляют только 2D-информацию. Описанный здесь протокол иммунофлуоресцентного окрашиван?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent Scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL	Eppendorf	Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	VWR	10836-004
Laser Scanning Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Software
Imaris 8.4.2	Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black	Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	Sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	Falcon	352070
5ml Syringe	Braun	4606108V
Cover slips	Thermo Scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158	Components of TEA
16% Formaldehyde Solution	Thermo Scientific	28908	use as a 4% solution
Acetic acid	Merck	100063	Components of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Normal goat serum	Sigma	NS02L
Sucrose	Sigma	S1888-1kg
Tris-base	Roche	TRIS-RO	Components of TEA
Triton X-100	Sigma	T8787-250ml	Diluted to 1% in PBS
Tween 20	Sigma	P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL	Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL	Cp-pharma	31303
Oxygen 5 L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Cell Signaling Technology	#4412	diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647	Invitrogen	#A-21247	diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43	Sigma	C6219	diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)	Invitrogen	MA3-903	diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring			Self-designed and 3D printed
Plasticine	Cernit	49655005
Silikonpasten, Baysilone	VWR	291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6	The Jackson Laboratory