АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для быстрой идентификации белков, продуцируемых геномно секвенированных патогенными бактериями, с использованием тандемной масс-спектрометрии MALDI-TOF-TOF и нисходящего протеомного анализа с программным обеспечением, разработанным на месте. Метастабильные ионы белка фрагментируются из-за эффекта аспарагиновой кислоты, и эта специфичность используется для идентификации белка.

Аннотация

Этот протокол идентифицирует белки иммунитета бактерицидных ферментов: колицина E3 и бактериоцина, продуцируемых патогенным штаммом Escherichia coli с использованием индукции антибиотиков и идентифицированных тандемной масс-спектрометрией MALDI-TOF-TOF и нисходящим протеомным анализом с помощью программного обеспечения, разработанного на месте. Белок иммунитета колицина E3 (Im3) и белок иммунитета бактериоцина (Im-Bac) были идентифицированы из заметных ионов фрагментов b- и/или Y-типа, генерируемых полипептидным расщеплением позвоночника (PBC) на С-концевой стороне аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и остатков аспарагина механизмом фрагментации эффекта аспарагиновой кислоты. Программное обеспечение быстро сканирует последовательности белков в силико, полученные из секвенирования всего генома бактериального штамма. Программное обеспечение также итеративно удаляет аминокислотные остатки белковой последовательности в случае, если зрелая белковая последовательность усечена. Одна белковая последовательность обладала массой и фрагментами ионов, согласуемых с теми, которые были обнаружены для каждого белка иммунитета. Затем последовательность-кандидат проверялась вручную, чтобы подтвердить, что все обнаруженные фрагменты ионов могут быть назначены. N-концевой метионин Im3 был постпереводно удален, тогда как Im-Bac имел полную последовательность. Кроме того, мы обнаружили, что только два или три некомментарных фрагмента ионов, образованных ПБК, необходимы для идентификации правильной последовательности белка. Наконец, промотор (SOS box) был идентифицирован перед генами антибактериального и иммунитета в плазмидном геноме бактериального штамма.

Введение

Анализ и идентификация непереваренных белков методом масс-спектрометрии называется нисходящим протеомным анализом1,2,3,4. В настоящее время это устоявшийся метод, который использует электрораспрозревшение ионизацию (ESI)5 и анализаторы массы высокого разрешения6,а также сложные методы диссоциации, например, диссоциацию переноса электронов (ETD), диссоциацию захвата электронов (ECD)7,ультрафиолетовую фотодиссоциацию (UV-PD)8и т. Д.

Другим методом мягкой ионизации является матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)9,10,11, которая менее широко используется для анализа сверху вниз, отчасти потому, что она в основном связана с анализаторами массы времени пролета (TOF), которые имеют ограниченное разрешение по сравнению с другими анализаторами массы. Несмотря на эти ограничения, инструменты MALDI-TOF и MALDI-TOF-TOF были использованы для быстрого нисходящего анализа чистых белков и фракционированных и нефракционированных смесей белков. Для идентификации чистых белков распад в источнике (ISD) является особенно полезным методом, поскольку он позволяет проводить масс-спектрометрический (MS) анализ ионов фрагментов ФРАГМЕНТОВ ISD, а также тандемную масс-спектрометрию (MS / MS) фрагментов ионов белков, обеспечивающих последовательно-специфический фрагмент часто из N- и C-терминов целевого белка, аналогично секвенированию Эдмана12,13 . Недостатком подхода ISD является то, что, как и в секвенировании Эдмана, образец должен содержать только один белок. Одна потребность в белке обусловлена необходимостью однозначного отнесения фрагментов ионов к иону-предшественнику. Если в образце присутствуют два или более белков, может быть трудно назначить, какие фрагменты ионов принадлежат к каким ионам-предшественникам.

Атрибуция фрагментов ионов/ионов-предшественников может быть решена с помощью MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Как и в любом классическом эксперименте с МС/МС, ионы-предшественники массово выбираются/выделяются до фрагментации, и обнаруженные фрагментированные ионы могут быть отнесены к конкретному иону-предшественнику. Однако методы диссоциации, доступные для этого подхода, ограничены в первую очередь диссоциацией, вызванной столкновением высоких энергий (HE-CID)14 или распадом после источника (PSD)15,16. HE-CID и PSD наиболее эффективны при фрагментации пептидов и небольших белков, и охват последовательности в некоторых случаях может быть ограничен. Кроме того, PSD приводит к расщеплению полипептидной магистрали (PBC) в первую очередь на стороне C-концевой стороны остатков аспарагиновой и глутаминовой кислоты явлением, называемым эффектом аспарагиновой кислоты17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS также нашла нишу в таксономической идентификации микроорганизмов: бактерий21,грибов22и вирусов23. Например, спектры MS используются для идентификации неизвестных бактерий путем сравнения с эталонной библиотекой MS-спектров известных бактерий с использованием алгоритмов распознавания образов для сравнения. Этот подход оказался весьма успешным из-за его скорости и простоты, хотя и требовал ночной культивирования изолята. Ионы белка, обнаруженные при этом подходе (обычно менее 20 кДа), содержат отпечаток РС, позволяющий таксономическое разрешение на уровне рода и вида, а в некоторых случаях и на подвиде24 и штаммеуровня 25,26. Однако остается необходимость не только таксономически классифицировать потенциально патогенные микроорганизмы, но и идентифицировать специфические факторы вирулентности, токсины и факторы устойчивости к противомикробным препаратам (УВМ). Для этого масса пептидов, белков или малых молекул измеряется РС и впоследствии выделяется и фрагментируется МС/МС.

Патогенные бактерии часто несут круговые куски ДНК, называемые плазмидами. Плазмиды, наряду с профагами, являются основным вектором горизонтального переноса генов между бактериями и отвечают за быстрое распространение устойчивости к противомикробным препаратам и других факторов вирулентности среди бактерий. Плазмиды могут также нести антибактериальные (AB) гены, например, колицин и бактериоцин. Когда эти гены экспрессируются и белки секретируются, они действуют, чтобы отключить механизм трансляции белка соседних бактерий, занимающих ту же экологическую нишу27. Однако эти бактерицидные ферменты также могут представлять риск для хозяина, который их произвел. В результате ген совместно экспрессируется хозяином, который специфически ингибирует функцию фермента AB и называется его белком иммунитета (Im).

Повреждающие ДНК антибиотики, такие как митомицин-С и ципрофлоксацин, часто используются для индуцирования ответа SOS у токсин-продуцирующей шига E. coli (STEC), чей ген токсина Шига(stx) обнаружен в геноме профага, присутствующем в бактериальном геноме28. Ранее мы использовали индукцию антибиотиков, MALDI-TOF-TOF-MS / MS и нисходящий протеомный анализ для обнаружения и идентификации типов и подтипов Stx, продуцируемых штаммами STEC29,30,31,32. В предыдущей работе штамм STEC O113:H21 RM7788 культивировали в течение ночи на агаровых средах, дополненных митомицином-С. Однако вместо того, чтобы обнаружить ожидаемую B-субъединицу Stx2a при m/z ~7816, другой ион белка был обнаружен при m/z ~7839 и идентифицирован как плазмидно-кодируемый гипотетический белок неизвестной функции33. В текущей работе мы идентифицировали два плазмидно-кодированных белка AB-Im, продуцируемых этим штаммом, используя индукцию антибиотиков, MALDI-TOF-TOF-MS / MS и нисходящий протеомный анализ с использованием автономного программного обеспечения, разработанного для обработки и сканирования последовательностей белков в силико, полученных из секвенирования всего генома (WGS). Кроме того, в программное обеспечение была включена возможность модификаций постперевода (PTM), включающих усечение последовательностей. Белки иммунитета были идентифицированы с помощью этого программного обеспечения из измеренной массы зрелого иона белка и последовательно-специфических фрагментов ионов из ПБК, вызванных эффектом аспарагиновой кислоты и обнаруженных MS / MS-PSD. Наконец, промотор был идентифицирован выше генов AB / Im в геноме плазмиды, что может объяснить экспрессию этих генов, когда этот штамм подвергается воздействию повреждающего ДНК антибиотика. Части этой работы были представлены на виртуальной встрече и выставке Национального американского химического общества осень 2020 года (17-20 августа 2020 года)34.

протокол

1. Микробиологическая пробоподготовка

  1. Инокулировать 25 мл бульона Лурии (LB) в коническую трубку 50 мл штаммом E. coli O113:H21 RM7788 (или другим бактериальным штаммом) из глицеринового бульона с использованием стерильной петли 1 мкл. Заколоть трубку и предварительно культивную культуру при 37 °C с встряхиванием (200 об/мин) в течение 4 ч.
  2. Aliquot 100 мкл предварительно культивированного бульона и выкладывается на агаровую пластину LB, дополненную 400 или 800 нг/мл митомицина-C. Культивирует агартовые пластины статически на ночь в инкубаторе при 37 °C.
    ВНИМАНИЕ: Штаммы STEC являются патогенными микроорганизмами. Выполняйте все микробиологические манипуляции, помимо культивирования, в шкафу биобезопасности BSL-2.
  3. Собирайте бактериальные клетки из отдельных видимых колоний с помощью стерильной петли 1 мкл и перекладывайте в 2,0 мл уплотнительную кольцевую микроцентрифужную трубку, содержащую 300 мкл воды класса ВЭЖХ. Закутайте трубку, вихрь ненадолго и центрифугу при 11,337 x g в течение 2 мин, чтобы гранулировать клетки.

2. Масс-спектрометрия

  1. Нанесите 0,75 мкл аликвоты супернатанта образца на мишень MALDI из нержавеющей стали и дайте ему высохнуть. Налейте высушенное место образца аликвотой a0,75 мкл насыщенного раствора синапиновой кислоты в 33% ацетонитриле, 67% воде и 0,2% трифторуксусной кислоты. Дайте пятну высохнуть.
  2. Анализ высушенных мест отбора проб с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF-TOF.
    1. После загрузки цели MALDI в масс-спектрометр нажмите кнопку получения линейного режима MS в программном обеспечении для сбора. Введите диапазон m/z для анализа, введя m/z нижней и верхней границ (например, от 2 кДа до 20 кДа) в соответствующие поля в программном обеспечении метода сбора.
    2. Нажмите на место образца для анализа целевого шаблона MALDI в программном обеспечении. Затем нажмите левую кнопку мыши и перетащите курсор мыши на место образца, чтобы указать прямоугольную область, которая будет отобрана для лазерной абляции / ионизации. Отпустите кнопку мыши, и начнется сбор. Соберите 1000 лазерных снимков для каждого образца пятна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор данных отображается в режиме реального времени в окне сбора программного обеспечения.
    3. Если ионы не обнаружены, увеличьте интенсивность лазера, отрегулировав скользящую шкалу в разделе «Интенсивность лазера» в программном обеспечении до тех пор, пока не будет обнаружен сигнал ионов белка. Это называется порогом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед точечным анализом образца провести внешнюю калибровку прибора в линейном режиме MS с белковыми калибрантами, m/z которых охватывают диапазон анализируемого, например, состояния заряда +1 и +2 белковых калибрантов: цитохром-С, лизоцим и миоглобин охватывают диапазон масс от 2 кДа до 20 кДа. Промежуточная масса в указанном диапазоне масс используется в качестве фокусной массы, например, 9 кДа. Фокусная масса - это ион, м/з которого оптимально сфокусирован для обнаружения детектором линейного режима.
    4. Когда сбор данных в линейном режиме MS завершен, нажмите кнопку получения в программном обеспечении для получения в режиме рефлектрона MS/MS. Введите массу прекурсора для анализа в поле Масса прекурсора. Затем введите ширину изоляции (в Da) в окно массы предшественника для стороны низкой и высокой массы массы предшественника, например, ±100 Da.
    5. Нажмите на кнопку CID Off. Нажмите кнопку Metastable Suppressor ON. Отрегулируйте интенсивность лазера не менее 90% от его максимального значения, отрегулировав скользящую шкалу под лазерной интенсивностью в программном обеспечении.
    6. Нажмите на место образца для анализа целевого шаблона MALDI в программном обеспечении. Затем нажмите левую кнопку мыши и перетащите курсор мыши на место образца, чтобы указать прямоугольную область, которая будет отобрана для лазерной абляции / ионизации. Отпустите кнопку мыши, и начнется сбор. Соберите 10 000 лазерных снимков для каждого образца пятна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед точечным анализом образца прибор должен быть откалиброван снаружи в режиме MS/MS-рефлектрона с использованием фрагментов ионов из пост-исходного распада (PSD) состояния заряда +1 алкилированного тиоредоксина35.
  3. Не обрабатывайте необработанные данные MS. Обрабатывайте необработанные данные MS/MS-PSD, используя следующую последовательность шагов в указанном порядке: расширенная коррекция базовой линии (32, 0,5, 0,0) с последующим удалением шума (два стандартных отклонения) с последующим гауссовским сглаживанием (31 балл).
  4. Вручную проверяют данные MS/MS-PSD на наличие заметных фрагментов ионов, генерируемых PBC19,20.
  5. Оценка данных MS/MS в отношении абсолютного и относительного количества фрагмент-ионов и их сигнал-шум (S/N). Используйте только наиболее распространенные фрагменты ионов для идентификации белка, особенно если данные MS / MS-PSD шумные.

3. Построение базы данных белков in silico

  1. Сгенерируйте текстовый файл, содержащий в силико белковые последовательности бактериального штамма, который будет сканироваться программным обеспечением Protein Biomarker Seeker для идентификации белка. Белковые последовательности получены из секвенирования всего генома (WGS) анализируемого штамма (или близкородственного штамма).
  2. Зайдите на веб-сайт NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), чтобы загрузить около 5000 белковых последовательностей конкретного бактериального штамма (например, Escherichia coli O113:H21 штамм RM7788), который анализируется. Максимальный размер загружаемого файла составляет 200 последовательностей.
    1. В результате скопируйте и вставьте 25 загрузок в один текстовый файл. Выберите формат FASTA (текстовый) для каждой загрузки.

4. Управление программным обеспечением для искателей биомаркеров белка

  1. Дважды щелкните исполняемый файл Protein Biomarker Seeker. Появится окно графического интерфейса пользователя (GUI)(рисунок 1,верхняя панель).
  2. Введите массу белкового биомаркера (измеренную в MS-линейном режиме) в поле «Масса зрелого белка». Затем введите погрешность измерения массы в поле «Допуск по массе». Стандартная погрешность измерения массы составляет ±10 Да для белка 10 000 Да.
  3. При желании нажмите кнопку Калькулятор комплементарной ионной белковой массы b/y, чтобы рассчитать массу белка из предполагаемой комплементарной пары ионов фрагментов (CFIP или b/y). Появится всплывающее окно, Protein Mass Calculator Tool(Рисунок 1,нижняя панель).
    1. Введите m/z предполагаемого CFIP и нажмите кнопку Add Pair (Добавить пару). Появится рассчитанная белковая масса.
    2. Скопируйте и вставьте это число в поле «Масса зрелого белка» и закройте окно инструмента «Калькулятор массы белка».
  4. Выберите длину сигнального пептида N-терминала, щелкнув поле Установить ограничение остатков. Появится всплывающее окно со скользящей шкалой и курсором. Наведите курсор на нужную длину сигнального пептида (максимум 50). Если длина сигнального пептида не выбрана, программное обеспечение будет выполнять неограниченное усечение последовательности.
  5. В разделе Условие фрагмента ионов в графическом интерфейсе выберите остатки для расщепления полипептидной основы (PBC). Нажмите на поля с одним или несколькими остатками: D, E, N и/или P.
    1. Нажмите на кнопку Ввести фрагменты ионов (+1) для поиска. Появится всплываемая страница фрагмента. Затем нажмите на кнопку «Добавить ион фрагмента», которая соответствует количеству вводимых ионов фрагмента, т. е. одним щелчком мыши для каждого иона фрагмента. Появится раскрывающееся поле для каждого вводимого фрагмента.
    2. Введите m/z ионов фрагментов и связанный с ними допуск m/z. По завершении нажмите кнопку Сохранить и закрыть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разумный допуск по м/з составляет ±1,5.
    3. Выберите минимальное количество ионов фрагментов, которое должно быть сопоставлено для идентификации, прокрутив до нужного числа в поле справа от поля Сколько ионов фрагментов должно быть сопоставлено.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три матча должны быть адекватными.
    4. Выберите остатки цистеина, чтобы они были в окисленном состоянии, щелкнув по соответствующему кругу. Если после поиска идентификация белка не найдена, повторите поиск с цистеинами в их пониженном состоянии. Если после поиска идентификация не найдена, увеличьте допуск ионов фрагментов до ±3 и повторите поиск.
  6. В разделе Настройка файланажмите кнопку Выбрать файл FASTA, чтобы просмотреть и выбрать файл FASTA (текстовый), содержащий последовательности белков in silico бактериального штамма, ранее построенные на этапах протокола 3.1-3.2. Затем выберите выходную папку и создайте имя выходного файла.
  7. Нажмите кнопку Запустить поиск по записям файлов. Появится всплывающее окно под названием Confirm Search Parameters (рисунок 1,нижняя панель), отображающее параметры поиска до начала поиска.
  8. Если параметры поиска верны, нажмите на кнопку Начать поиск. Если параметры поиска неверны, нажмите на кнопку Отмена и повторно введите правильные параметры. Как только поиск инициируется, окно параметров закрывается, и появляется новое всплывающее окно с индикатором выполнения(рисунок 1,нижняя панель), показывающее ход поиска и бегущий подсчет количества найденных идентификаций.
  9. По завершении поиска (несколько секунд) индикатор выполнения автоматически закрывается, и в поле Log графического интерфейса отображается сводка поиска(рисунок 2,верхняя панель). Кроме того, появится новое всплывающее окно, отображающее идентификацию белка, если таковая имеется(рисунок 2,нижняя панель).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности белка in silico, имеющие нераспознанные остатки, например, U или X, автоматически пропускаются из анализа, и эти последовательности впоследствии сообщаются с помощью отдельного всплывающего окна, чтобы предупредить оператора о том, какие (если таковые имеются) последовательности были пропущены по завершении поиска.

5. Пост-поисковое подтверждение последовательности белка

  1. Подтвердите правильность последовательности кандидатов методом ручного анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью программного обеспечения Protein Biomarker Seeker является идентификация последовательности белка с высокой точностью путем исключения многих явно неправильных белковых последовательностей из рассмотрения и включения усечения последовательностей в качестве возможного PTM в зрелом белке. Поскольку количество возвращаемых возможных последовательностей-кандидатов несоко, ручное подтверждение является управляемым.
  2. Сгенерировать таблицу средних m/z фрагментов b- и y-типа последовательности-кандидата с помощью любой масс-спектрометрии или протеомного программного обеспечения, обладающего такой функциональностью. Сравните среднее значение m/z ионов фрагментов in silico на С-концевой стороне D-, E- и N-остатков (и на N-концевой стороне P-остатков) с m/z заметных фрагментов ионов из данных MS/MS-PSD.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее заметные ионы фрагментов MS/MS-PSD должны быть легко сопоставлены с D-, E- и N-ассоциированными ионами фрагментов кремния. Однако механизм фрагментации эффекта аспарагиновой кислоты менее эффективен вблизи N- или С-терминов белковой последовательности36.

Результаты

На рисунке 3 (верхняя панель) показан MS штамма STEC O113:H21 RM7788, культивируемого в течение ночи на LBA, дополненном 400 нг/мл митомицина-C. Пики при m/z 7276, 7337 и 7841 были ранее идентифицированы как белок холодового шока C (CspC), белок холодного шока E (CspE) и плазмидный белок неизвестной фун...

Обсуждение

Вопросы протокола
Основными сильными сторонами текущего протокола являются его скорость, простота подготовки образцов и использование инструмента, который относительно прост в эксплуатации, обучении и обслуживании. Хотя протеомный анализ снизу вверх и сверху вниз с помощ?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Программное обеспечение Protein Biomarker Seeker находится в свободном доступе (бесплатно), связавшись с Клифтоном К. Фагерквистом по clifton.fagerquist@usda.gov. Мы хотим отметить поддержку этого исследования грантом ARS, USDA, CRIS: 2030-42000-051-00-D.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4000 Series Explorer softwareAB SciexVersion 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF AnalyzerAB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS gradeFisher ChemicalA996-1
BSL-2 biohazard cabinetThe Baker CompanySG403A-HE
Cytochrome-CSigmaC2867-10MG
Data Explorer softwareAB SciexVersion 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kitG-Biosciences786-231
GPMAW softwareLighthouse DataVersion 10.0
IncubatorVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria BrothInvitrogen12795-027
LysozymeSigmaL4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ringFisher Scientific02-681-343
MiniSpin Plus CentrifugeEppendorf22620207
Mitomycin-C (from streptomyces)Sigma-AldrichM0440-5MG
MyoglobinSigmaM5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420Thermo ScientificModel 420
Sinapinic acidThermo Scientific1861580
Sterile 1 uL loopsFisher Scientific22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant)SigmaT0910-1MG
Trifluoroacetic acidSigma-Aldrich299537-100G
Water Optima LC/MS gradeFisher ChemicalW6-4

Ссылки

  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. . ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. . Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены