АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол, в котором отдельные клетки контролируются на острые события и продуктивную инфекцию ВИЧ-1 на нанофлюидном устройстве. Данные визуализации определяют взаимодействие вируса и рецептора хозяина и динамику сигнального пути. Это первый метод нанофлюидной высокопроизводительной продольной одноклеточной культуры и визуализации для изучения кинетики передачи сигналов и молекулярных взаимодействий.

Аннотация

ВИЧ-1 вызывает хроническую инфекцию, которая поражает более 37 миллионов человек во всем мире. Люди, живущие с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), испытывают коморбидность, связанную с хроническим воспалением, несмотря на антиретровирусную терапию. Однако эти воспалительные сигналы не были полностью охарактеризованы. Роль ранних событий входа в активацию клеточных сигнальных событий и последующей экспрессии генов не была отражена на уровне одной клетки. Здесь авторы описывают метод, который применяет принципы флуоресцентной микроскопии живых клеток к автоматизированной одноклеточной платформе, которая культурирует и визуаизирует клетки в течение пользовательских курсов времени, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ динамических клеточных процессов. Этот анализ может отслеживать одноклеточную живую флуоресцентную микроскопию ранних событий, которые непосредственно следуют за инфекцией ВИЧ-1, в частности приток кальция, который сопровождает воздействие вируса и развитие продуктивной инфекции с использованием флуоресцентного репортерного вируса. Клетки MT-4 нагружают чувствительным к кальцию красителем и культивируют в изолированных ручках на нанофлюидном устройстве. Культивированные клетки инфицированы вирусом-репортером ВИЧ-1 (ВИЧ-1 NLCI). Флуоресцентный микроскоп, расположенный над нанофлюидным устройством, измеряет приток кальция в течение 8-минутного временного времени после острого воздействия ВИЧ-1. Продуктивная инфекция ВИЧ-1 измеряется в тех же клетках в течение 4-дневного интервала. Данные визуализации из этих временных курсов анализируются для определения взаимодействий вируса и рецептора хозяина и динамики сигнального пути. Авторы представляют интегрированную, масштабируемую альтернативу традиционным методам визуализации с использованием новой оптофлюидной платформы, способной к одноклеточной сортировке, культивации, визуализации и автоматизации программного обеспечения. Этот анализ может измерять кинетику событий при различных условиях, включая тип клетки, агонист или эффект антагониста, при измерении массива параметров. Это первый установленный метод для нанофлюидной высокопроизводительной продольной одноклеточной культуры и визуализации: этот метод может быть широко адаптирован для изучения кинетики клеточной сигнализации и динамических молекулярных взаимодействий.

Введение

Хроническое воспаление является основной причиной ВИЧ-ассоциированных ранних заболеваний и смертности1,2,3. Существует несколько механизмов, посредством которых ВИЧ может активировать воспалительную сигнализацию, и последние данные свидетельствуют о роли рецепторов P2X во входеВИЧ,которые являются кальциево-гатирующими аденозинтрифосфатными (АТФ) рецепторами3,4,5,6,7,8,9,10. Подтип пуринергических рецепторов P2X (P2XR) может быть важным фактором этого воспаления. Однако молекулярные механизмы взаимодействий ВИЧ-P2XR в значительной степени неизвестны и могут влиять на ранние и поздние этапы жизненного цикла вируса ВИЧ-1. Определение путей и кинетики, приводящих к хроническому воспалению, связанному с ВИЧ, имеет решающее значение для продвижения вариантов лечения людей с ВИЧ.

Чтобы оценить, агонизирует ли ВИЧ-1 непосредственно рецепторы P2X, активация P2XR и инфекция ВИЧ-1 должны измеряться параллельно. Независимо установлены анализы активности P2XR и инфекции ВИЧ-1: клеточный приток кальция является показателем активации P2XR, а продуктивная инфекция ВИЧ-1 может быть количественно определена по обилию РНК. Флуоресцентное обнаружение притока кальция возможно с помощью чувствительного к кальцию красителя Fluo-4, а вич-1-инфекцию можно визуализировать с помощью флуоресцентного репортерного вируса ВИЧ-NLCI11,12,13,14,15.

Поскольку эти показатели активации P2X (острый клеточный приток кальция) и инфекции ВИЧ-1 (синтез РНК ВИЧ-1) происходят в разных временных масштабах (минуты против дней), отсутствует высокопроизводительный метод, который позволяет проводить парный анализ активации P2XR и инфекции ВИЧ-1. Стандартные высокопроизводительные экспериментальные методы, такие как проточная цитометрия, позволяют проводить популяционный анализ, но не могут оценить взаимосвязь между острыми и продольными событиями в отдельных клетках. Альтернативно, одноклеточная визуализация со стандартной флуоресцентной микроскопией является низкопроизводительной. Эти экспериментальные ограничения представляют собой потребность в новых высокопроизводительных методах измерения связей между острыми и продольными клеточными событиями напрямую.

Описанная оптофлюидная система представляет собой новую платформу, способную к одноклеточной сортировке и изоляции, культивации, визуализации и программной автоматизации16,17,18,19. Эта система представляет собой интегрированную, высокопроизводительную альтернативу ограничениям традиционных методов визуализации. Платформа Beacon состоит из углекислого газа (CO2)и инкубатора с контролируемой температурой, который поддерживает ячейки, содержащиеся на чипе. Чип обладает светочувствительными транзисторами, которые генерируют электрический градиент в ответ на целевой свет. Эта результирующая диэлектрофоретическая сила используется для перемещения отдельных клеток через нанофлюидный чип в нужные области. Клетки сортируются в ручки на чипе, которые обеспечивают барьер для физической изоляции отдельных клеток. Непрерывный ламинарный поток питательных сред по всему чипу предотвращает миграцию клеток из ручек, обеспечивая при этом диффузию питательных веществ и реагентов, специфичных для эксперимента, рассеивая мелкие частицы. Флуоресцентный микроскоп находится над чипом. Программная автоматизация используется для захвата изображений чипа в указанный пользователем момент времени.

Всю клеточную характеристику выполняли с использованием оптофлюидной системы для одноклеточного отбора и манипуляций. Эта система состоит из интегрированных механических, микрофлюидных и оптических компонентов, которые позволяют манипулировать одноклеточными клетками, проводить анализ, культивировать и визуализировать. Клетки загружаются и культивируются на одноразовом нанофлюидном устройстве, состоящем из 3 500 отдельных камер (ручек), каждая из которых способна удерживать субнанолитровый объем. Клетки могут быть расположены внутри ручек с использованием светоиндуцированных диэлектрофоретических «клеток» и культивированы в условиях, контролируемых температурой иCO2. Микрофлюидика позволяет перфузию сред или буферов на чипе для клеточной культуры или лечения лекарственными препаратами. Приводимая в действие игла позволяет импортировать и экспортировать клетки из инкубированных и закрытых пластин колодца. Область чипа может быть визуализирована при 4-кратном или 10-кратном увеличении в ярко-полевом и флуоресцентном каналах (включая DAPI, FITC, TRed или Cy5) для характеристики клеточных фенотипов или функционального анализа. Вся система автоматизирована с помощью программного обеспечения, которое можно использовать для предварительно разработанных рабочих процессов или пользовательских экспериментов.

Были изучены взаимосвязи между вич-1-инфекцией и P2XR, но о высокопроизводительной процедуре для непосредственной характеристики этих взаимодействий параллельно не сообщалось. Здесь авторы описывают методологию изучения взаимодействий ВИЧ-P2XR путем отслеживания острого притока кальция и последующей продуктивной инфекции ВИЧ-1 на одноклеточном уровне. Примечательно, что это создает новый инструмент, который позволяет проводить прямые, высокопроизводительный, продольные измерения нескольких мишеней в отдельных клетках.

протокол

1. Подготовка клеток к визуализации

  1. Приготовьте свежий загрузочный раствор Fluo-4 AM: Добавьте 25 мкл 100x концентрированного моющего растворителя, затем добавьте 2,5 мкл Fluo-4 AM 1000x в трубку 1,5 мл. Вихрь для смешивания.
  2. Пипетка 2,5 мл питательной среды в загрузочный раствор и инвертируется для смешивания. Защита от света.
  3. Центрифуга 2 x 106 МТ-4 ячейки при 500 х г в течение 3 мин.
  4. Удалите мочную м и повторно суспендируют гранулы в 2 мл подготовленного загрузочного раствора Fluo-4 AM. Защита от света.
  5. Пипетка повторно суспендирует клетки в 35-миллиметровую чашку Петри. Инкубировать при 37 °C в течение 15-30 мин, затем инкубировать еще 15-30 мин при комнатной температуре.
  6. Перенесите клеточную суспензию в трубку центрифуги. Центрифужные ячейки при 500 х г в течение 3 мин удаляют супернатант, состоящий из нагрузочного раствора.
  7. Повторно суспендируют ячейку гранулы путем пипетки в 1 мл питательной среды и центрифуги при 500 х г в течение 3 мин до промывки.
  8. Повторно суспендируют клеточную гранулу путем пипетки в культуральная среда в концентрации 2 х 106 клеток/мл (минимум 50 мкл). Защита от света.

2. Подготовка оптофлюидной системы, загрузка клеток и выемка клеток

  1. Приготовьте чип с смачивающим раствором, который облегчает выемку клеток.
    1. Для этого загрузите на прибор трубки центрифуги, содержащие 2 мл смачивающего раствора и 50 мл воды DI, с помощью нового оптофлюидного чипа и запустите функцию Wet Chip. Эта функция автоматически заполнит чип смачивающим раствором через системную жидкость, инкубирует чип при 50° °C и промывает чип водой 3 раза.
    2. После промывки водой промывки промывки чипа 3 циклами по 250 мкл питательной среды.
  2. Дополните клеточную суспензию из шага 1.8 моющим средством F-127 1:127 перед загрузкой, чтобы уменьшить вероятность прилипания клеток к каналам чипа.
  3. Используйте иглу экспорта инструмента для импорта ячеек из центрифужной трубки объемом 1,5 мл с помощью операции Load и Small Volume Import для объема упаковки ячейки 5 мкл.
  4. Перьевые ячейки, использующие оптимизированное напряжение оптоэлектронного позиционирования (OEP) 4,3 В и скорость сепаратора 5 мкм/с. Пеннинг происходит с помощью OEP. Выполните запись с помощью функции Autopen, которая автоматически обопределит отдельные ячейки, окружит их клеткой OEP и переместит их в ближайшую ручку. Если интересующие ячейки остаются после автоматического написания, используйте функцию Ручное перо для выбора целевых ячеек (щелчком мыши) и целевого пера (с последующим щелчком мыши).
  5. После завершения написания (либо после завершения функции Autopen, либо после достижения желаемого количества клеток), промыть чип 3 циклами по 250 мкл культуральной среды, чтобы очистить любую оставшуюся незакопченную ячейку от чипа.

3. Одноклеточная инфекция и функциональная визуализация

  1. После написания клеток получите флуоресцентные изображения клеток в каналах FITC, Texas Red и DAPI для измерения исходного уровня Fluo-4, mCherry и автофлуоресценции.
  2. Вливать ВИЧ-1 в микрочип в концентрации 13 нг ВИЧ-1 NL-CI на 2 х 106 клеток, медленно пипетируя суспензию в чип через экспортную иглу.
  3. Сразу после добавления ВИЧ-1 многократно получать изображения в каналах FITC и DAPI в течение 10-минутного временного курса.
  4. Получайте изображения в каналах Texas Red и DAPI через 1, 2, 3 и 4 дня после заражения (DPI).

4. Анализ данных функциональной визуализации одной клетки с помощью программного обеспечения FIJI

  1. В каждой точке времени в каждом интересуемом канале визуализации используйте инструмент FIJI Point Selection и функцию Measure для измерения сигналов Fluo-4, mCherry и автофлуоресценции каждой ячейки. Одновременно измерьте фоновую флуоресценцию, вычислив среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) пера и чипа, содержащего каждую ячейку.
  2. Управление фоновой флуоресценцией и автофлуоресценцией с помощью функции «Измерение» для поиска MFI в выборе области и вычитания этого значения из значения флуоресценции ячейки.
  3. Нормализуйте фоновую флуоресценцию каждого изображения чипа: измерьте MFI чипа в каждом поле. Затем вычтите MFI чипа с наименьшей фоновой флуоресценцией из всех других измерений микросхем MFI.
  4. Нормализуйте фоновую флуоресценцию каждой клеточной ручки: измерьте МФИ пера каждой клетки в каждом поле зрения. Затем вычтите это значение из необработанного MFI ячейки для каждого поля.
  5. Контроль для автофлуоресценции клеток: Вычтите день 0 и день 4 DAPI MFI каждой ячейки из дня 0 и день 4 мВс.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует формат чипа и необработанных данных изображения, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа. Идентификация и кластеризация неинфицированных и инфицированных клеток с помощью измерения mCherry показаны на рисунке 2. Эти кластер...

Обсуждение

Описанная методика изучения взаимосвязи между притоком кальция и продуктивной инфекцией ВИЧ-1 в отдельных клетках может быть адаптирована для изучения внутриклеточной кинетики кальция в ответ на другие интересующий агонисты или антагонисты. Подготовка клеток к визуализации проста, ?...

Раскрытие информации

R.P.S. является сотрудником Sema4. У других авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы благодарны за научные дискуссии с доктором Бенджамином Ченом. Эта работа финансировалась K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS и KB) и R21AI152833 (THS и KB).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
 Beacon Optofluidic SystemBerkeley Lights
 Fetal Bovine SerumGibco
 FIJIOpen-source softwarePMID: 22743772, 22930834
 Fluo-4 Calcium Imaging KitThermo Fisher F10489
 HIV-1 NLCINL4-3Laboratory of Benjamin ChenPMID: 28148796
 Hyclone Pennecillin Streptomycin solutionGE Healthcare Life sciences SV30010
 MT-4 cellsNIH AIDS Reagent ARP-120
 OptoSelect 3500 chipBerkeley Lights
 Pipettor TipsDenville Scientific P3020-CPS
 Prism 9.0.0GraphPad
 RPMI-1640 MediumSigma-Aldrich R8758
Serological PipettesFisher Brand 13-678-11E
Tissue Culture HoodVarious models
T75 flasksCorning3073

Ссылки

  1. Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
  2. Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
  3. Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
  4. Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
  5. Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
  6. Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
  7. Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
  8. Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
  9. Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
  10. Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
  11. Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
  12. Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
  13. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  14. He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
  15. Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
  16. Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
  17. Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
  18. Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
  19. Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
  20. Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
  21. Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
  22. Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены