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요약

여기서, 우리는 나노 유체 장치에 있는 급성 사건 및 생산적인 HIV-1 감염을 위해 단 하나 세포가 감시되는 프로토콜을 제시합니다. 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의합니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 이미징을 위한 첫번째 방법이다 운동및 분자 상호 작용을 연구하기 위하여.

초록

HIV-1은 전 세계적으로 3,700만 명 이상에게 영향을 미치는 만성 감염을 일으킵니다. 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)와 함께 사는 사람들은 항 레트로 바이러스 치료에도 불구하고 만성 염증과 관련된 혼변성을 경험합니다. 그러나 이러한 염증 성 신호는 완전히 특징적이지 않았습니다. 세포 신호 이벤트 및 다운스트림 유전자 발현의 활성화에 대한 초기 진입 이벤트의 역할은 단일 세포 수준에서 포착되지 않았습니다. 여기서 저자는 동적 셀룰러 프로세스의 높은 처리량 분석을 허용하는 사용자 맞춤형 시간 과정을 통해 배양 및 이미지 세포를 배양하는 자동화 된 단일 셀 플랫폼에 살아있는 세포 형광 현미경 검사법의 원리를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 분석법은 HIV-1 감염을 즉시 따르는 초기 사건의 단일 세포 살아있는 형광 현미경 검사법, 특히 바이러스에 노출과 형광 기자 바이러스를 사용하여 생산적인 감염의 발달을 수반하는 칼슘의 유입을 추적할 수 있습니다. MT-4 세포는 칼슘에 민감한 염료를 장착하고 나노유체 장치에 있는 격리된 펜에서 배양됩니다. 배양된 세포는 HIV-1 리포터 바이러스(HIV-1 NLCI)에 감염된다. 나노유체 장치 위에 위치한 형광 현미경은 급성 HIV-1 노출 후 8분 의 시간 과정을 통해 칼슘 유입을 측정합니다. HIV-1 생산성 감염은 4일 간격을 통해 동일한 세포에서 측정됩니다. 이 시간 과정의 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의하기 위해 분석됩니다. 저자는 단일 세포 정렬, 배양, 이미징 및 소프트웨어 자동화가 가능한 새로운 광유체 플랫폼을 사용하여 전통적인 이미징 방법에 대한 통합적이고 확장 가능한 대안을 제시합니다. 이 분석체는 매개 변수의 배열을 측정하는 동안 세포 유형, 고뇌스트 또는 길항제 효과를 포함한 다양한 조건하에서 이벤트의 운동학을 측정할 수 있습니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 화상 진찰을 위한 첫번째 확립된 방법입니다: 이 기술은 세포 신호 운동및 동적 분자 상호 작용을 공부하기 위하여 광범위하게 적응될 수 있습니다.

서문

만성 염증은 HIV와 관련된 초기 이환율및 사망률1,2,3의주요 원인입니다. HIV가 염증 신호를 활성화할 수 있는 여러 메커니즘이 있으며, 최근 증거는 칼슘 게이팅 아데노신 삼위산염(ATP) 수용체3,4,4,5,6,7,8,9,10인HIV 항목에서 P2X 수용체에 대한 역할을 시사한다. 퓨리너기체 수용체의 P2X 특수형(P2XR)은 이 염증의 중요한 촉진자가 될 수 있다. 그러나, HIV-P2XR 상호 작용의 분자 기계장치는 크게 알려지지 않으며 초기 및 늦은 HIV-1 바이러스 성 수명 주기 단계에 영향을 미칠 수 있습니다. HIV 관련 만성 염증을 유발하는 경로와 운동학을 정의하는 것은 HIV 를 가진 사람들을 위한 치료 옵션을 발전시키는 데 중요합니다.

HIV-1이 P2X 수용체를 직접 고통스럽게 하는지 여부를 평가하려면 P2XR 활성화 및 HIV-1 감염을 병렬로 측정해야 합니다. P2XR 활성 및 HIV-1 감염의 분석이 독립적으로 확립되었습니다: 세포 칼슘 유입은 P2XR 활성화의 지표이며, HIV-1 생산적인 감염은 RNA 풍부에 의해 정량화될 수 있다. 플루오-4 칼슘 에 민감한 염료로 칼슘 유입의 형광 검출이 가능하며, HIV-1 감염은 mCherry 형광 기자 바이러스 HIV-NLCI11,12,13,14,15로시각화될 수 있다.

P2X 활성화(급성 세포 칼슘 유입) 및 HIV-1 감염(HIV-1 RNA 합성)의 이러한 지표는 다른 시간대(분 대 일)에서 발생하기 때문에 P2XR 활성화 및 HIV-1 감염의 쌍을 이루는 분석을 허용하는 고처리량 방법이 부족합니다. 유동 세포측정과 같은 표준 고처리량 실험 기술은 인구 분석을 허용하지만 단일 세포에서 급성 및 세로 이벤트 사이의 관계를 평가할 수 없습니다. 대안적으로, 표준 형광 현미경 검사를 가진 단세포 화상 진찰은 낮은 처리량입니다. 이러한 실험적 한계는 급성 및 세로 세포 이벤트 사이의 연관성을 직접 측정하는 새로운 높은 처리량 기술의 필요성을 제시합니다.

설명된 광유체 시스템은 단일 세포 분류 및 격리, 배양, 이미징 및 소프트웨어 자동화16,17,18,19를할 수 있는 새로운 플랫폼이다. 이 시스템은 기존의 이미징 방법의 한계에 대한 통합된 높은 처리량 대안을 제시합니다. 비콘 플랫폼은 칩에 포함된 세포를 지원하는이산화탄소(CO2)및 온도 제어 인큐베이터로 구성됩니다. 칩에는 표적 광에 대응하여 전기 그라데이션을 생성하는 감광성 트랜지스터가 있습니다. 이 결과 이 생성 된 이전기 력은 나노 유체 칩을 가로 질러 개별 세포를 원하는 영역으로 이동하는 데 사용됩니다. 세포는 칩의 펜으로 정렬되어 개별 세포를 물리적으로 격리하는 장벽을 제공합니다. 칩 전체의 성장 매체의 연속 라미나르 흐름은 펜에서 세포 이동을 방지하면서 영양소와 실험별 시약의 작은 입자 확산을 허용합니다. 형광 현미경은 칩 위에 앉아 있다. 소프트웨어 자동화는 사용자가 지정한 시점에서 칩이미지를 캡처하는 데 사용됩니다.

모든 세포 특성화는 단세포 선택 및 조작을 위한 광유체 시스템을 사용하여 수행되었다. 이 시스템은 단일 세포 조작, 분석, 배양 및 이미징을 가능하게 하는 통합 기계, 미세 유체 및 광학 부품으로 구성됩니다. 세포는 3,500개의 개별 챔버(pens)로 구성된 일회용 나노유체 장치에 적재 및 배양되며, 각 장치는 하위 나노리터 부피를 보유할 수 있습니다. 세포는 빛 유도 된 디전기 전성 "케이지"를 사용하여 펜 내에서 배치될 수 있으며 온도 및 CO2-제어조건하에서 배양 될 수 있습니다. 미세 유체는 세포 배양 또는 약물 치료를 위한 칩에 미디어 또는 버퍼의 관류를 허용합니다. 작동 바늘은 배양 및 셔터 웰 플레이트에서 세포의 가져오기 및 수출을 허용합니다. 칩 영역은 세포 표현형 또는 기능적 분석을 특성화하기 위해 브라이트필드 및 형광 채널(DAPI, FITC, TRed 또는 Cy5 포함)에서 4배 또는 10배 배율로 배율할 수 있다. 전체 시스템은 미리 설계된 워크플로 또는 사용자 지정 실험에 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 자동화됩니다.

HIV-1 감염과 P2XR 사이의 관계는 연구되었지만 이러한 상호 작용을 병렬로 직접 특성화하는 높은 처리량 절차는 보고되지 않았습니다. 여기에서 저자는 단일 세포 수준에서 급성 칼슘 유입 및 후속 HIV-1 생산감염을 추적하여 HIV-P2XR 상호 작용을 연구하는 방법론을 설명합니다. 특히, 이것은 단일 셀에서 여러 표적의 직접적이고 높은 처리량, 세로 측정을 허용하는 새로운 도구를 설정합니다.

프로토콜

1. 이미징을 위한 세포 준비

  1. 신선한 플루오-4 AM 로딩 솔루션 준비: 100x 농축 세제 용매의 25 μL을 추가한 다음 플루오-4 AM 1000x2.5 μL을 1.5mL 튜브에 추가합니다. 혼합 소용돌이.
  2. 배양 매체의 파이펫 2.5 mL을 로딩 솔루션으로 전환하여 혼합합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
  3. 원심분리기 2 x 106 MT-4 셀500 x g에서 3 분 동안.
  4. 제조된 플루오-4 AM 로딩 용액의 2mL에서 미디어를 제거하고 펠릿을 다시 분리합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
  5. 파이펫은 세포를 35mm 페트리 접시에 다시 매달아 넣습니다. 15-30 분 동안 37 °C에서 인큐베이션한 다음 실온에서 15-30 분 추가로 배양하십시오.
  6. 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기다. 원심분리기 셀은 500 x g에서 3분 동안 로딩 용액으로 구성된 상퍼를 제거합니다.
  7. 배양 배지의 1mL로 배양 배지및 원심분리기의 파이프를 500 x g에서 3분 동안 세척하여 세포 펠릿을 다시 분리한다.
  8. 2 x 106 세포/mL(최소 50 μL)의 농도에서 배양 배지에서 배양 배지에서 배관하여 세포 펠릿을 재연한다. 빛으로부터 보호하십시오.

2. 광유체 시스템 준비, 세포 적재 및 세포 페닝

  1. 젖은 용액으로 칩을 준비하여 세포 페닝을 용이하게 합니다.
    1. 이를 위해 2mL의 습윤 용액과 50mL의 DI 물을 포함하는 원심분리기 튜브를 새로운 광유체 칩으로 기기에 적재하고 습식 칩 기능을 실행합니다. 이 기능은 시스템 유동성을 통해 습윤 용액으로 칩을 자동으로 범람시키고, 50, °C에서 칩을 배양하고 3 번 물로 칩을 플러시합니다.
    2. 물 플러싱이 완료되면, 문화 매체의 250 μL의 3 주기로 칩을 플러시.
  2. 1:100 F-127 세제용 세제를 1.8단계에서 보충하여 칩 채널에 달라붙는 세포의 가능성을 줄입니다.
  3. 계측기 내보내기 바늘을 사용하여 하중 동작및 소형 체적 가져오기를 사용하여 1.5mL 원심분리기 튜브에서 5 μL 셀 패키지 부피에 대한 셀을 가져옵니다.
  4. 4.3 V 및 5 μm/s 케이지 속도의 최적화된 광전자 위치(OEP) 전압을 사용하는 펜 셀. 페닝은 OEP를 사용하여 발생합니다. 단일 셀을 자동으로 감지하고 OEP 케이지로 둘러싸서 근처 펜으로 이동하는 Autopen 함수를 사용하여 페닝을 수행합니다. 관심 있는 셀이 자동 페닝을 따라 남아 있는 경우 수동 펜 함수를 사용하여 대상 셀(마우스 클릭) 및 대상 펜(후속 마우스 클릭)을 선택합니다.
  5. 페닝이 완료되면(오토펜 기능이 완료되거나 원하는 수의 페닝 셀이 달성되었을 때) 칩을 250μL의 3사이클로 플러시하여 칩에서 남은 미펜드 셀을 제거합니다.

3. 단세포 감염 및 기능 화상 진찰

  1. 페닝 세포 후, FITC, 텍사스 레드 및 DAPI 채널에서 세포의 형광 이미지를 얻어 기준형 플루오-4, mCherry 및 자동 형광을 측정합니다.
  2. 2 x 106 세포당 HIV-1 NL-CI의 13 ng 농도에서 마이크로칩에 HIV-1을 주입하여 수출 바늘을 통해 칩내로 서스펜션을 천천히 피펫팅합니다.
  3. HIV-1 추가 직후, 10분 의 시간 과정을 통해 FITC 및 DAPI 채널에서 이미지를 반복적으로 얻습니다.
  4. 텍사스 레드 및 DAPI 채널에서 1일, 2일, 3일 및 4일 후 감염(DPI)에서 이미지를 가져옵니다.

4. 피지 소프트웨어로 단세포 기능 이미징 데이터 분석

  1. 관심있는 각 이미징 채널의 각 시점에서, 피지 포인트 선택 도구와 측정 기능을 사용하여 각 셀의 플루오-4, mCherry 및 자동 형광 신호를 측정합니다. 동시에 각 셀을 포함하는 펜과 칩의 평균 형광 강도(MFI)를 계산하여 배경 형광을 측정합니다.
  2. 측정 기능을 사용하여 영역 선택에서 MFI를 찾고 이 값을 세포 형광 값에서 빼서 배경 형광 및 자동 형광에 대한 제어.
  3. 각 칩 이미지의 배경 형광을 정규화: 각 필드의 칩MFI를 측정합니다. 그런 다음 다른 모든 칩 MFI 측정에서 가장 적은 배경 형광으로 칩의 MFI를 뺍니다.
  4. 각 셀 함유 펜의 배경 형광을 정규화: 각 시야에서 각 셀 펜의 MFI를 측정합니다. 그런 다음 각 필드에 대해 셀의 원시 MFI에서 이 값을 뺍니다.
  5. 세포 자동 불피성 제어: 0일 및 4mCherry MFI에서 각 셀의 0일 및 4 DAPI MFI를 빼는다.

결과

도 1은 형광 현미경을 통해 획득한 칩 및 원시 이미징 데이터의 형식을 도시한다. mCherry 측정을 통해 감염되지 않은 및 감염된 세포의 식별 및 클러스터링은 도 2에도시된다. 이 클러스터는 HIV 감염 된 세포에 있는 초기 칼슘 유입을 보여주는 그림 3에있는 칼슘 유입 운동학을 위해 분석됩니다. 도 4는 칼슘 유...

토론

단일 세포에서 칼슘 유입과 HIV-1 생산감염 사이의 관계를 연구하는 기술된 방법론은 다른 작용제 또는 관심있는 길항제에 대한 응답으로 세포내 칼슘 운동학을 연구하도록 적응할 수 있다. 이미징을 위한 세포 의 준비는 간단하고 최소한의 시간 집약적이며, 시약은 널리 사용되는 제조업체의 편리한 키트에서 사용할 수 있습니다. 플루오-4 기반 칼슘 측정은 문헌에 잘 설명되어 있으며, HIV-1은 이 ?...

공개

R.P.S.는 세마4의 직원입니다. 다른 저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

우리는 벤자민 첸 박사와의 과학적 토론에 감사드립니다. 이 작품은 K08AI120806(THS), R01DA052255(THS 및 KB), R21AI152833(THS 및 KB)의 지원을 받았습니다.

자료

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 Hyclone Pennecillin Streptomycin solutionGE Healthcare Life sciences SV30010
 MT-4 cellsNIH AIDS Reagent ARP-120
 OptoSelect 3500 chipBerkeley Lights
 Pipettor TipsDenville Scientific P3020-CPS
 Prism 9.0.0GraphPad
 RPMI-1640 MediumSigma-Aldrich R8758
Serological PipettesFisher Brand 13-678-11E
Tissue Culture HoodVarious models
T75 flasksCorning3073

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