Микроструктурный анализ для измерения хиральности клеток

Резюме

Представлен протокол определения многоклеточной хиральности in vitro с использованием методики микроструктурирования. Этот анализ позволяет автоматически количественно определять смещения влево-вправо различных типов клеток и может использоваться для целей скрининга.

Аннотация

Хиральность — это внутреннее клеточное свойство, которое изображает асимметрию с точки зрения поляризации вдоль лево-правой оси клетки. Поскольку это уникальное свойство привлекает все большее внимание из-за его важной роли как в развитии, так и в заболевании, стандартизированный метод количественной оценки для характеристики хиральности клеток будет способствовать исследованиям и потенциальным приложениям. В этом протоколе мы описываем многоклеточный анализ характеристик хиральности, который использует микроструктурированные массивы клеток. Сотовые микрошарики изготавливаются на стеклянных слайдах с титановым/золотым покрытием с помощью микроконтактной печати. После посева на геометрически определенных (например, кольцеобразных) островах, покрытых белком, клетки направленно мигрируют и образуют смещенное выравнивание в сторону либо по часовой стрелке, либо против часовой стрелки, которое может быть автоматически проанализировано и количественно определено с помощью специально написанной программы MATLAB. Здесь мы подробно описываем изготовление микроструктурированных субстратов, посев клеток, сбор изображений и анализ данных и показываем репрезентативные результаты, полученные с использованием клеток NIH/3T3. Этот протокол ранее был подтвержден в нескольких опубликованных исследованиях и является эффективным и надежным инструментом для изучения хиральности клеток in vitro.

Введение

Лево-правая (LR) асимметрия клетки, также известная как клеточная рука или хиральность, описывает полярность клетки в оси LR и признается фундаментальным, сохраненным, биофизическим свойством 1,2,3,4,5. Хиральность клеток наблюдалась как in vivo, так и in vitro в нескольких масштабах. Предыдущие результаты показали хиральное закручивание актинового цитоскелета в одиночных клетках, посеянных на круглых островах⁶, смещенную миграцию и выравнивание клеток в пределах ограниченных границ 7,8,9,10,11 и асимметричное зацикливание куриной тепловой трубки ¹².

На многоклеточном уровне хиральность клеток может быть определена по направленной миграции или выравниванию, клеточному вращению, динамике цитоскелета и позиционированию органелл клеток 7,8,9,10,11,12,13. Мы создали анализ¹⁴ на основе микроструктурирования для эффективной характеристики хирального смещения адгезивных клеток 7,8,9,10. С кольцеобразными микроструктурами, геометрически ограничивающими кластеры клеток, клетки в совокупности демонстрируют направленную миграцию и смещенное выравнивание. Была разработана программа MATLAB для автоматического обнаружения и измерения выравнивания клеток на фазоконтрастных изображениях кольца. Направление локального выравнивания ячейки количественно определяется с углом смещения в зависимости от его отклонения от окружного направления. После статистического анализа кольцевая картина клеток обозначается либо как смещения против часовой стрелки (CCW), либо как смещения по часовой стрелке (CW).

Этот анализ был использован для характеристики хиральности нескольких клеточных фенотипов (таблица 1), и было обнаружено, что асимметрия клеток LR является фенотип-специфической ^7,11,15. Более того, нарушение динамики и морфологии актина может привести к обращению вспять хирального смещения ^7,8, а окислительный стресс может также изменить хиральность клеток⁹. Из-за простоты процедуры и надежности подхода ^7,8,9,10, этот 2D-анализ хиральности обеспечивает эффективный и надежный инструмент для определения и изучения многоклеточной хиральности in vitro.

Целью данного протокола является демонстрация использования данного метода для характеристики хиральности клеток. Этот протокол описывает, как изготавливать узорчатые сотовые массивы с помощью метода микроконтактной печати и проводить анализ хиральности автоматическим способом с помощью программы MATLAB.

протокол

1. Изготовление марок полидиметилсилоксана (PDMS)¹⁶

1. Нарисуйте массив микромасштабных колец с помощью программного обеспечения CAD с внутренним диаметром 250 мкм и внешним диаметром 450 мкм. Шаблон, используемый в этом протоколе, представляет собой массив 10 x 10 с расстоянием между кольцами 850 мкм.
2. Распечатайте маску прозрачности узора в нужном разрешении с помощью сервиса печати масок компании микрофабрикации (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Было доказано, что предоставленные размеры кольца работают для многих типов клеток⁷.
3. Проводят ультрафиолетовую (УФ) фотолитографию с помощью маски, содержащей желаемые признаки, чтобы сделать отрицательный фоторезист формы (например, СУ-8)⁸.
   1. Накройте силиконовую пластину, покрытую фоторезистом, прозрачной маской, изготовленной на этапах 1.1-1.2.
   2. На УФ-контактном элайнере полимеризуйте фоторезист под прозрачными областями маски ультрафиолетовым светом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После дальнейшей стирки и разработки изготавливается мастер-форма с желаемыми характеристиками⁸. Эксплуатационные детали зависят от конкретного используемого оборудования.
4. Приготовьте эластомерные преполимеры PDMS, смешав с его отверждающим агентом в соотношении 10:1, а затем отлил смесь на форму в чашке Петри.
5. Поместите посуду в вакуумную камеру на 30 мин для удаления пузырьков воздуха в PDMS и выпекайте в духовке при 60 °C в течение не менее 2 ч.
6. После полного отверждения PDMS вырежьте массивы узоров на штампы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстые штампы (около 1 см) могут быть предпочтительными из-за простоты обращения на более поздних этапах микроконтактной печати.

2. Покрытие стеклянных горок

1. Очистите стеклянные горки. Замочите горки в 100% этаноловой ванне, обработайте ультразвуком в течение 5 минут, а затем промойте водой.
2. Повторите этот шаг сначала с ацетоном, затем с изопропанолом, с последующей сушкой в потоке азота.
3. Используйте электронно-лучевое (E-лучевое) испарительное оборудование для покрытия слоев титана и золота на стеклянных слайдах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для титанового слоя желаемая толщина составляет 15 Å (1 Å = ^10-10 м). Для золотого слоя желаемая толщина составляет 150 Å. Покройте сначала титан, а затем золото, так как титановый слой служит клеем между золотом и стеклянной горкой.
4. Поместите очищенные слайды в испарительную камеру и вставьте золотые и титановые тигли под жалюзи.
5. Откачайте камеру для создания вакуума ниже ^10-5 Па перед плавкой металлов. Сфокусируйте электронный пучок на металле и отрегулируйте мощность таким образом, чтобы скорость осаждения соответствовала контролю толщины осаждения.
6. Откройте затвор, чтобы начать осаждение металла. Закройте затвор, когда будет достигнута желаемая толщина.
7. Переключайте тигли между последовательным испарением двух металлов.
8. Подождите, пока тигли остынут, как того требует оборудование, проветрите камеру и выньте стекла с золотым покрытием.
9. Снова откачайте камеру для обслуживания оборудования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксплуатационные детали могут зависеть от конкретного испарителя e-beam. Важно иметь хорошо контролируемую, низкую скорость осаждения титана. Толстый слой титана часто приводит к плохой видимости, особенно для флуоресцентной визуализации клеток. После нанесения покрытия стеклянные слайды с титановым/золотым покрытием можно хранить в сухой вакуумной камере при комнатной температуре не менее 1 месяца.

3. Микроконтактная печать

1. При желании разрежьте слайд с титановым/золотым покрытием на более мелкие кусочки. Квадратная форма размером 12 мм x 12 мм рекомендуется для типичного применения (рисунок 1B).
2. Используйте стеклорез, чтобы скользить по поверхности, чтобы оставить помятый след, затем держите стеклянную горку с обеих сторон и согните вмятину, чтобы разбиться на небольшие четверти. Избегайте прикосновения к поверхности, покрытой золотом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуально определить, с какой стороны стекла находится поверхность с покрытием в случае случайного опрокидывания, сравните отражение света с обеих сторон. Покрытая золотом поверхность будет показывать более яркое отражение, тогда как сторона без покрытия будет иметь более тусклое отражение (от титанового слоя на другой стороне стекла). Альтернативным способом является наблюдение за краями скольжения, а сторона покрытия может быть определена по вертикальной режущей поверхности.
3. Очистите слайды, замочив в 100% этаноле в чашке Петри золотой стороной вверх на орбитальном шейкере не менее 10 минут. Аспирируйте этанол, затем высушите каждую горку, продувая потоком азота.
4. Очистите штампы PDMS мыльной водой, а затем 100% этанолом. Высушите штампы газообразным азотом.
5. Готовят 2 мМ раствора октадеканетиола (С18), растворяя 5,74 мг порошка С18 в 10 мл 100% этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Герметизируйте и храните раствор C18 при комнатной температуре. Печать узоров с помощью C18 создает клейкий самосборный монослой, для которого фибронектин и клетки будут предпочтительно прикрепляться.
6. Замочите штампы PDMS в растворе C18 с узорчатой поверхностью вниз в течение 10 с и аккуратно высушите газообразным азотом в течение 60 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сушке поместите поток подальше от штампа сначала (около 1 м), пока большая часть жидкости не испарится, а затем медленно переместите поток ближе, чтобы полностью высушить штамп. Это делается для того, чтобы раствор C18 не сдувался вместо высыхания на штампе.
7. Положите штамп лицевой стороной вниз на золотые слайды в течение 60 секунд перед снятием.
8. Чтобы обеспечить правильную штамповку, осторожно постучите пинцетом по штампам, чтобы правильно перенести узоры. Не давите слишком сильно, и вес пинцета обычно достаточен.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуальный осмотр штампа во время постукивания обеспечит равномерный контакт штампа и стекла.
9. Подготовьте влажностные камеры.
   1. Пипетка 1 мл 70% этанола в перевернутую крышку чашки Петри и укладывает кусок парапленки, чтобы покрыть поверхность (покрытую лицевой стороной вверх).
   2. Используйте пинцет для подъема, уложите парапленку, чтобы убедиться, что нет пузырьков воздуха, и удалите избыток этанола, если это необходимо.
10. Готовят 2 мМ HS-(CH₂)_{11-EG 3-OH} (EG3) раствор: Разбавляют 5 мкл исходного раствора в 5 мл 100% этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленный раствор EG3 можно герметизировать и хранить при температуре 4 °C, а неразбавленный запас EG3 следует хранить при -20 °C. Обработка EG3 используется для того, чтобы сделать область стекла без C18 неадгезионной к клеткам.
11. Микропипетки 40 мкл капель EG3 на каждую четверть стекла скользят по парапленке в камере влажности, оставляя достаточно места между каплями, чтобы учесть расстояние между золотыми слайдами.
12. Используйте пинцет, чтобы поместить золотые слайды с печатью C18 лицевой стороной вниз на капли и обеспечить отсутствие пузырьков под слайдами. Осторожно сожмите горки вместе, не поднимая их, чтобы свести к минимуму испарение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите один край стекла скользить вниз рядом с каплей, а затем медленно опуская другой конец стекла скользить вниз. Если пузырь присутствует, толкайте золотую горку, не поднимая ее, пока пузырь больше не исчезнет.
13. Плотно запечатайте чашку Петри парапленкой и оставьте при комнатной температуре не менее 3 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется обширная инкубация, дважды запечатайте чашку Петри и оставьте ее на срок до 24 ч.
14. В шкафу для биобезопасности поместите золотые слайды лицевой стороной вверх в чашку Петри, замочите и промойте 3 раза в 70% этаноле, чтобы удалить EG3, затем оставьте в этаноле на 10 минут для стерилизации.
15. Аспирируйте этанол и замените его стерильным PBS.
16. Подготовьте еще одну камеру влажности, как описано в шаге 3.9, с PBS вместо этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за разницы в поверхностном натяжении легче сначала добавить 4-5 мл PBS для укладки парапленки и удаления пузырьков, а затем аспирировать избыток.
17. Приготовьте раствор фибронектина 50 мкг/мл (другие белки, при желании) в стерильном PBS и микропипетке 50 мкл капель раствора фибронектина на каждую четверть скользить по парапленке, оставляя некоторое пространство между каплями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фибронектиновое покрытие облегчает адгезию клеток к узорчатым поверхностям.
18. Используйте вафельный пинцет, чтобы поместить слайды лицом вниз на капли и обеспечить отсутствие пузырьков под слайдами. Осторожно сдвиньте горки вместе, не поднимая их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки слайдов рекомендуются стеклянные скользящие пинцеты или вафельные пинцеты с прямыми широкими наконечниками.
19. Оставьте чашку Петри в шкафу биобезопасности на 30 минут.
20. Через 30 мин поместите золотые горки лицевой стороной вверх в PBS после промывки в течение 3 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды с фибронектиновым узором могут храниться в PBS при 4 °C в течение примерно месяца.

4. Посев клеток на микроструктурированные слайды

1. Разогрейте среду для культивирования клеток и трипсин на водяной бане при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующее описание субкультуры относится к клеткам NIH/3T3. Условия культивирования могут варьироваться в зависимости от типов клеток.
2. (Необязательно) Замачивайте узорчатые слайды в культуральной среде в 12-луночной пластине, нагревайте до 37 °C в инкубаторе перед трипсинизацией клеток для лучшего прикрепления клеток.
3. Трипсинизируют клетки, нейтрализуют FBS-содержащими средами, центрифугируют при 100 х г в течение 3 мин, а затем повторно суспендируют, хорошо смешивая со свежими средами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки полностью диссоциированы друг от друга.
4. Подсчитайте ячейки, разбавьте до 200 000 клеток/мл и добавьте 0,5 мл клеточной суспензии к каждой лунке, содержащей один золотой слайд.
5. Осторожно встряхните пластину лунки несколько раз для равномерного посева клеток и храните ее в инкубаторе в течение 15 минут, чтобы обеспечить прикрепление клеток.
6. Через 15 минут проверьте прикрепление клеток под микроскопом. При необходимости выделите дополнительное время.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прикрепленные ячейки будут распространяться по поверхности с видимым филоподием или сплющиванием и не будут перемещаться с поверхности при осторожном постукивании или перемещении плиты скважины.
7. Аспирируйте среду, содержащую неприкрепленные клетки, из каждой лунки и добавляйте 1 мл культуральной среды. Для медикаментозного лечения добавьте дополнительные реагенты к питательным средам на этом этапе.
8. Культивируйте клетки в инкубаторе в течение 24 ч и проверяйте слияние, чтобы определить, сформировалась ли хиральность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства типов клеток рекомендуется слияние выше 75%, а чрезмерное слияние может повлиять на характеристику хиральности.

5. Коллекция изображений

1. Фиксируйте клетки при слиянии.
   1. Удалите питательные среды с пластины лунки и промойте один раз PBS.
   2. Добавить 4% раствор параформальдегида, инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем промыть 3 раза PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если фиксация значительно изменяет морфологию клеток, рекомендуется визуализация перед фиксацией
2. Используйте фазоконтрастный микроскоп с функциональностью камеры, изображайте каждое кольцо на слайдах с высоким разрешением (для анализа достаточно объектива 10x).

6. Характеристика хиральности клеток (рисунок 2)

1. Загрузите файлы кода MATLAB для характеристики хиральности из дополнительных файлов (Дополнительный файл 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Код был протестирован для работы с MATLAB_R2015b и более поздними версиями на системах Windows и macOS. Набор инструментов круговой статистики также необходим для запуска файлов, которые можно найти в ссылке¹⁷.
2. Добавьте папку кода и вложенные папки (с панелью инструментов круговой статистики внутри) в путь MATLAB и откройте файл "ROI_selection.m". В строке 4 измените каталог на нужную папку данных (для пользователей окон переключите "/" на "\" в строках 4 и 5).
3. Измените размер изображения в строке 14, причем первые две фигуры представляют размер внутреннего круга кольца, а два других — внешний.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что размеры всех изображений в анализируемой папке идентичны.
4. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы выполнить код MATLAB «ROI_selection.m», чтобы определить интересующую область (ROI) в фазоконтрастных изображениях.
5. Вручную перетащите квадрат выделения, чтобы он соответствовал кольцу, затем дважды щелкните изображение, чтобы подтвердить выделение.
6. Повторите этот шаг для каждого изображения в папке (следующее изображение автоматически появится после подтверждения выбора ROI предыдущего изображения); будет сгенерирован файл ".mat" для хранения информации о рентабельности инвестиций для каждого изображения.
7. Откройте файл "Analysis_batch.m" и измените каталог папки так же, как шаг 6.2. (Для пользователей окон при первом использовании переключите "/" на "\" в строках 5, 6, 124 и 130)
8. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы выполнить код «Analysis_batch.m», чтобы определить хиральность нескольких клеточных кольцевых паттернов. Будет сгенерирован файл "datatoexcel.txt", содержащий круговую статистику для каждого кольца, а также числа колец по часовой стрелке, без хиральной и против часовой стрелки.

Результаты

Через пятнадцать минут после посева клеток NIH/3T3 адгезия клеток на кольцевом рисунке была визуально подтверждена фазово-контрастной визуализацией. После последующей культивирования в течение 24 ч клетки на узорах становились сливающимися и вытянутыми с явно асимметричными выравниван?...

Обсуждение

Кольцеобразный анализ паттернов, описанный здесь, обеспечивает простой в использовании инструмент для количественной характеристики многоклеточной хиральности, способный давать высоконадежные и повторяемые результаты. Быстрая генерация идентичных микросред и непредвзятый анализ ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 proof ethanol	Koptec	DSP-MD-43
BZX microscope system	Keyence	BZX-600
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Electron beam evaporator	Temscal	BJD-1800	Gold-titanum film coating
Fetal bovine serum	VWR	89510-186
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG
Glass microscope slides	VWR	10024-048
Glass tweezers	Exelta	390BSAPI
Gold evaporation pellets	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658
OAI contact aligner	OAI	200	UV photolithography
Octadecanethiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Orbital shaker	VWR	89032-088
Phosphate buffered saline (PBS)	Research product international	P32080-100T
Polydimethylsiloxane Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Silicon Wafer	University Wafer	ID#809
Sodium pyruvate	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Titanium evaporation pellets	International Advanced Materials	TI14
Transparency mask (with feature)	Outputicity.com	N/A	Mask printing service
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo fisher scientific	25200-072