Um ensaio de micropatterning para medir a quiralidade celular

Resumo

Apresentamos um protocolo para determinar a quiralidade multicelular in vitro, utilizando a técnica de micropatterning. Este ensaio permite quantificação automática dos vieses esquerdo-direito de vários tipos de células e pode ser usado para fins de triagem.

Resumo

A quiralidade é uma propriedade celular intrínseca, que retrata a assimetria em termos de polarização ao longo do eixo esquerda-direita da célula. Como essa propriedade única atrai cada vez mais atenção devido aos seus importantes papéis no desenvolvimento e na doença, um método padronizado de quantificação para caracterizar a quiralidade celular avançaria na pesquisa e em aplicações potenciais. Neste protocolo, descrevemos um ensaio de caracterização de quiralidade multicelular que utiliza matrizes micropattered de células. Micropatterns celulares são fabricados em lâminas de vidro revestidas de titânio/ouro por impressão de microcontatos. Após a semeadura na direção geométrica definida (por exemplo, em forma de anel), ilhas revestidas de proteínas, as células migram direcionalmente e formam um alinhamento tendencioso em direção ao sentido horário ou ao sentido anti-horário, que pode ser automaticamente analisado e quantificado por um programa MATLAB escrito sob medida. Aqui descrevemos em detalhes a fabricação de substratos micropatterados, semeadura celular, coleta de imagens e análise de dados e mostramos resultados representativos obtidos usando as células NIH/3T3. Este protocolo já foi validado anteriormente em vários estudos publicados e é uma ferramenta eficiente e confiável para estudar a quiralidade celular in vitro.

Introdução

A assimetria esquerda-direita (LR) da célula, também conhecida como mão celular ou quiralidade, descreve a polaridade celular no eixo LR e é reconhecida como uma propriedade fundamental, conservada, biofísica 1,2,3,4,5. A quiralidade celular tem sido observada tanto in vivo quanto in vitro em múltiplas escalas. Achados anteriores revelaram o redemoinho quiral de citesqueleto de actina em células únicas semeadas em ilhas circulares⁶, migração tendenciosa e alinhamento de células dentro dos limites confinados 7,8,9,10,11, e looping assimétrico do tubo de calor de frango ¹².

No nível multicelular, a quiralidade celular pode ser determinada a partir da migração ou alinhamento direcional, rotação celular, dinâmica citoesqueletal e posicionamento de organela celular 7,8,9,10,11,12,13. Estabelecemos um ensaio baseado em micropatterning¹⁴ para caracterizar eficientemente o viés quiral das células aderentes 7,8,9,10. Com os micropatterns em forma de anel geometricamente confinando aglomerados celulares, as células exibem coletivamente migração direcional e alinhamento tendencioso. Um programa MATLAB foi desenvolvido para detectar e medir automaticamente o alinhamento celular em imagens de contraste de fase do anel. A direção do alinhamento celular local é quantificada com um ângulo tendencioso, dependendo de seu desvio da direção circunferencial. Após a análise estatística, o padrão do anel das células é designado como vieses no sentido anti-horário (CCW) ou no sentido horário (CW).

Este ensaio tem sido usado para caracterizar a quiralidade de fenótipos de células múltiplas (Tabela 1), e a assimetria LR das células tem sido encontrada como fenótipo específico ^7,11,15. Além disso, a interrupção da dinâmica da actina e da morfologia pode resultar em uma reversão do viés quiral ^7,8, e o estresse oxidativo pode alterar a quiralidade celular também⁹. Devido à simplicidade do procedimento e à robustez da abordagem ^7,8,9,10, este ensaio de quiralidade 2D fornece uma ferramenta eficiente e confiável para determinar e estudar a quiralidade multicelular in vitro.

O objetivo deste protocolo é demonstrar o uso deste método para caracterizar a quiralidade celular. Este protocolo descreve como fabricar matrizes celulares padronizadas através da técnica de impressão de microcontatos e realizar análises de quiralidade de forma automatizada usando o programa MATLAB.

Protocolo

1. Fabricação de selos de polidimetilsiloxano (PDMS)¹⁶

1. Desenhe uma matriz de anéis de microescala usando o software CAD, com um diâmetro interno de 250 μm e um diâmetro externo de 450 μm. O padrão usado neste protocolo é uma matriz 10 x 10 com uma distância de 850 μm entre os anéis.
2. Imprima uma máscara de transparência do padrão na resolução desejada usando o serviço de impressão de máscaras de uma empresa de microfabização (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: As dimensões fornecidas do anel foram comprovadamente funcionas para muitos tipos^de células 7.
3. Realizar fotolitografia ultravioleta (UV) usando a máscara contendo características desejadas para fazer um molde fotoresistista negativo (como SU-8)⁸.
   1. Cubra um wafer de silício revestido com fotoresist pela máscara de transparência fabricada nas etapas 1.1-1.2.
   2. Em um alinhador de contato UV, polimerize o fotoresist sob regiões transparentes da máscara por luz UV.
      NOTA: Após mais lavagem e desenvolvimento, o molde mestre com características desejadas é fabricado⁸. Os detalhes operacionais dependem do equipamento específico utilizado.
4. Prepare os prepolímeros elastoméricos PDMS misturando-se com seu agente de cura em uma proporção de 10:1 e, em seguida, lançe a mistura sobre o molde em uma placa de Petri.
5. Coloque o prato em uma câmara de vácuo por 30 minutos para remover bolhas de ar em PDMS e assar em forno a 60 °C por pelo menos 2 h.
6. Após a cura completa do PDMS, corte as matrizes de padrão em selos.
   NOTA: Selos mais grossos (cerca de 1 cm) podem ser preferidos devido à facilidade de manuseio nas etapas posteriores da impressão de microcontatos.

2. Revestimento de lâminas de vidro

1. Limpe as lâminas de vidro. Mergulhe os slides em um banho de 100% etanol, sonicate por 5 min, e depois enxágue com água.
2. Repita este passo primeiro com acetona, depois com isopropanol, seguido de secagem em um fluxo de nitrogênio.
3. Use um equipamento de evaporação de feixe de elétrons (E-beam) para revestir camadas de titânio e ouro em lâminas de vidro.
   NOTA: Para a camada de titânio, a espessura desejada é de 15 Å (1 Å = ^10-10 m). Para a camada de ouro, a espessura desejada é de 150 Å. Cubra primeiro o titânio e depois o ouro, pois a camada de titânio serve como um adesivo entre o ouro e o deslizamento de vidro.
4. Coloque os slides limpos na câmara de evaporação e insira cadinhos de ouro e titânio sob as persianas.
5. Bombeie a câmara para criar um vácuo inferior a ^10-5 Pa antes de derreter metais. Concentre o feixe de elétrons no metal e ajuste a potência para que a taxa de depósito seja apropriada para controlar a espessura da deposição.
6. Abra o obturador para iniciar o depoimento de metal. Feche o obturador quando a espessura desejada for atingida.
7. Troque cadinhos entre evaporação sequencial de dois metais.
8. Aguarde que os cadinhos esfriem conforme necessário pelo equipamento, desabafem na câmara e levem os slides de vidro revestidos de ouro.
9. Bombeie a câmara novamente para manutenção do equipamento.
   NOTA: Os detalhes operacionais podem depender de um evaporador específico do feixe E. Ter uma taxa de depósito bem controlada e baixa de titânio é importante. Uma camada de titânio espessa muitas vezes leva à baixa visibilidade, especialmente para a imagem de fluorescência das células. Após o revestimento, os slides de vidro revestidos de titânio/ouro podem ser armazenados em uma câmara de vácuo seco à temperatura ambiente por pelo menos 1 mês.

3. Impressão de microcontato

1. Corte o slide revestido de titânio/ouro em pedaços menores, se desejar. Uma forma quadrada de 12 mm x 12 mm é recomendada para uma aplicação típica (Figura 1B).
2. Use um cortador de vidro para deslizar pela superfície para deixar uma faixa amassada, em seguida, segure o deslizamento de vidro em ambos os lados e dobre no amassado para quebrar em pequenos quartos. Evite tocar na superfície revestida com ouro.
   NOTA: Para determinar visualmente qual lado do vidro é a superfície revestida em caso de tombamento acidental, compare o reflexo da luz em ambos os lados. A superfície coberta de ouro mostrará um reflexo mais brilhante, enquanto o lado não revestido terá um reflexo mais dimmer (da camada de titânio do outro lado do vidro). Uma maneira alternativa é observar as bordas do slide, e o lado do revestimento pode ser determinado a partir da superfície de corte vertical.
3. Limpe os slides mergulhando em 100% de etanol em uma placa de Petri com o lado dourado em um agitador orbital por pelo menos 10 minutos. Aspire o etanol, depois seque cada lâmina soprando com um fluxo de nitrogênio.
4. Limpe os selos PDMS com água com sabão e depois 100% etanol. Seque os selos com gás nitrogênio.
5. Prepare a solução de octadesetol de 2 mM (C18) dissolvendo 5,74 mg de pó C18 em 10 mL de 100% etanol.
   NOTA: Vedar e armazene a solução C18 em temperatura ambiente. Padrões de impressão com C18 criam uma monocamada auto-montada adesivo para a qual a fibronectina e as células serão preferencialmente anexadas.
6. Mergulhe os selos PDMS na solução C18 com a superfície padronizada voltada para baixo para 10 s e suavemente seco com gás nitrogênio para 60 s.
   NOTA: Ao secar, coloque o fluxo longe primeiro do selo (cerca de 1 m) até que a maior parte do líquido seja evaporada e, em seguida, mova lentamente o fluxo mais perto de secar totalmente o carimbo. Isto é para evitar que a solução C18 seja explodida em vez de secar no selo.
7. Coloque o selo de cara para baixo nos slides de ouro por 60 s antes da remoção.
8. Para garantir a correta estampagem, bata suavemente as pinças nos selos para transferir corretamente os padrões. Não empurre para baixo muito forte, e o peso da pinça é tipicamente suficiente.
   NOTA: A inspeção visual do selo durante a batida garantirá que o selo e o slide de vidro tenham feito contato uniformemente.
9. Preparem câmaras de umidade.
   1. Pipeta 1 mL de 70% de etanol em uma tampa de placa de Petri invertida e deitar um pedaço de parafilme para cobrir a superfície (rosto coberto para cima).
   2. Use pinças para levantar, deite parafilm para garantir que não haja bolhas de ar e remova o excesso de etanol, se necessário.
10. Prepare a solução de 2 mM HS-(CH₂)_{11-EG 3-OH} (EG3): Diluir a solução de estoque de 5 μL em 5 mL de 100% de etanol.
    NOTA: A solução EG3 diluída pode ser selada e armazenada a 4 °C, e o estoque EG3 não diluído deve ser armazenado a -20 °C. O tratamento EG3 é usado para tornar a região de vidro sem C18 não adesivo para as células.
11. Micropipette 40 μL gotículas de EG3 para cada quarto de vidro desliza para o parafilme na câmara de umidade, deixando espaço suficiente entre gotículas para explicar o espaçamento dos slides de ouro.
12. Use pinças para colocar lâminas de ouro impressas em C18 de frente para as gotículas e garantir que não haja bolhas sob os slides. Empurre suavemente os slides juntos sem levantá-los para minimizar a evaporação.
    NOTA: Coloque uma borda do vidro desliza para baixo perto da gota e, em seguida, abaixando lentamente a outra extremidade do vidro deslize para baixo. Se uma bolha estiver presente, empurre o deslizamento de ouro sem levantá-la até que a bolha não esteja mais presente.
13. Sele firmemente a placa de Petri com parafilm e deixe-a em temperatura ambiente por pelo menos 3 h.
    NOTA: Se for desejada incubação extensiva, sele duas vezes a placa de Petri e deixe-a por até 24h.
14. Em um armário de biossegurança, coloque lâminas de ouro de frente para cima em uma placa de Petri, mergulhe e enxágue 3 vezes em 70% de etanol para remover o EG3, em seguida, deixe no etanol por 10 minutos para esterilização.
15. Aspire o etanol e substitua-o por PBS estéril.
16. Prepare outra câmara de umidade conforme descrito na etapa 3.9, com PBS em vez de etanol.
    NOTA: Devido à diferença na tensão superficial, é mais fácil primeiro adicionar 4-5 mL de PBS para estabelecer parafilm e remover bolhas, em seguida, aspirar o excesso.
17. Prepare a solução de fibronectina de 50 μg/mL (outras proteínas, se desejar) em PBS e micropipette 50 μL gotículas de solução de fibronectina para cada trimestre deslizar para o parafilme, deixando algum espaço entre gotículas.
    NOTA: O revestimento da fibronectina facilita a adesão celular a superfícies padronizadas.
18. Use pinças de wafer para colocar slides de frente para baixo nas gotículas e garantir que não haja bolhas sob os slides. Empurre suavemente os slides juntos sem levantá-los.
    NOTA: Pinças de deslizamento de vidro ou pinças de wafer com pontas largas retas são recomendadas para manusear os slides.
19. Deixe a placa de Petri no armário de biossegurança por 30 minutos.
20. Depois de 30 min, coloque os slides de ouro de frente para cima na PBS depois de enxaguar por 3 vezes.
    NOTA: Os slides com padrão fibronectina podem ser armazenados em PBS a 4 °C por cerca de um mês.

4. Semeando células em slides micropatterados

1. Aqueça a mídia de cultura celular e experimente em um banho de água de 37 °C.
   NOTA: A seguinte descrição da subcultura é para células NIH/3T3. As condições de cultura podem variar dependendo dos tipos de células.
2. (Opcional) Mergulhe slides padronizados em meios culturais em uma placa de 12 poços, aqueça até 37 °C em uma incubadora antes de tentarpsinização de células para melhor fixação celular.
3. Trypsinize as células, neutralize com mídia contendo FBS, centrífuga para baixo a 100 x g por 3 min e, em seguida, resuspend misturando-se bem com mídia fresca.
   NOTA: Certifique-se de que as células estão totalmente dissociadas umas das outras.
4. Conte as células, dilua para 200.000 células/mL e adicione 0,5 mL da suspensão celular a cada poço contendo um slide de ouro.
5. Agite suavemente a placa do poço algumas vezes para semeadura uniforme da célula e armazene-a em uma incubadora por 15 minutos para permitir a fixação celular.
6. Após 15 minutos, verifique o acessório da célula sob um microscópio. Permitir mais tempo, se necessário.
   NOTA: As células anexadas se espalharão na superfície com filopodium visível ou achatamento e não se moverão da superfície quando a placa do poço estiver suavemente batizada ou movida.
7. Aspire a mídia que contém células não-sectadas de cada poço e adicione 1 mL de mídia cultural. Para o tratamento medicamentoso, suplemente reagentes adicionais à mídia cultural nesta etapa.
8. Cultume as células na incubadora por 24h e verifique a confluência para determinar se a quiralidade se formou.
   NOTA: Acima de 75% a confluência é recomendada para a maioria dos tipos de células, e a super-confluência pode afetar a caracterização da quiralidade.

5. Coleção de imagens

1. Fixar as células em confluência.
   1. Remova a mídia de cultura da placa do poço e enxágue uma vez com PBS.
   2. Adicione 4% de solução de paraformaldeído, incubar à temperatura ambiente por 15 minutos e enxágue 3 vezes com PBS.
      NOTA: Se a fixação mudar significativamente a morfologia celular, a imagem antes da fixação é recomendada
2. Use um microscópio de contraste de fase com a funcionalidade da câmera, imagem cada anel nos slides em alta resolução (lente de objeto 10x é suficiente para análise).

6. Caracterização da quiralidade celular (Figura 2)

1. Baixe arquivos de código MATLAB para caracterização de quiralidade a partir dos arquivos suplementares (Arquivo Complementar 1).
   NOTA: O código foi testado para funcionar com MATLAB_R2015b e versões posteriores nos sistemas Windows e macOS. A caixa de ferramentas de estatísticas circulares também é necessária para executar os arquivos, que podem ser encontrados na referência¹⁷.
2. Adicione a pasta de código e as subpas (com caixa de ferramentas de estatísticas circulares dentro) ao caminho MATLAB e abra o arquivo "ROI_selection.m". Na linha 4, altere o diretório para a pasta de dados desejada (Para usuários de janela, mude "/" para "\" nas linhas 4 e 5).
3. Altere o tamanho da imagem na linha 14, com as duas primeiras figuras representando o tamanho do círculo interno do anel, enquanto as outras duas representam o exterior.
   NOTA: Certifique-se de que os tamanhos de todas as imagens em uma pasta a serem analisadas são idênticos.
4. Clique no botão Executar para executar o código MATLAB "ROI_selection.m" para determinar a região de interesse (ROI) em imagens de contraste de fase.
5. Arraste manualmente o quadrado de seleção para encaixar o anel e clique duas vezes na imagem para confirmar a seleção.
6. Repita esta etapa para cada imagem da pasta (a próxima imagem aparecerá automaticamente após confirmar a seleção do ROI de uma imagem anterior); um arquivo ".mat" será gerado para armazenar as informações do ROI para cada imagem.
7. Abra o arquivo "Analysis_batch.m" e altere o diretório da pasta da mesma etapa 6.2. (Para usuários de janelas, para uso pela primeira vez, mude "/" para "\" nas linhas 5, 6, 124 e 130)
8. Clique no botão Executar para executar o código "Analysis_batch.m" para determinar a quiralidade de vários padrões de anéis celulares. Um arquivo "datatoexcel.txt" será gerado, contendo estatísticas circulares para cada anel, bem como os números de anéis no sentido horário, não-quiral e anti-horário.

Resultados

Quinze minutos após a semeadura das células NIH/3T3, a adesão celular no padrão do anel foi confirmada visualmente por imagens de contraste de fase. Após a cultura subsequente de 24 h, as células nos padrões tornaram-se confluentes e alongadas com alinhamentos claramente assimétricos, tendenciosos em direção à direção do sentido horário (Figura 2). A migração direcional de células anexadas é registrada por imagens de lapso de tempo, motilidade celular e morfogênese podem s...

Discussão

O ensaio de padronização em forma de anel descrito aqui fornece uma ferramenta fácil de usar para caracterização quantitativa da quiralidade multicelular, capaz de produzir resultados altamente confiáveis e repetíveis. A geração rápida de microambientes definidos idênticos e análises imparcial permite o processamento automatizado de alto rendimento de grandes tamanhos de amostras. Este protocolo discute a fabricação dos micropatterns do anel, padronização celular e análise automática do alinhamento celu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 proof ethanol	Koptec	DSP-MD-43
BZX microscope system	Keyence	BZX-600
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Electron beam evaporator	Temscal	BJD-1800	Gold-titanum film coating
Fetal bovine serum	VWR	89510-186
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG
Glass microscope slides	VWR	10024-048
Glass tweezers	Exelta	390BSAPI
Gold evaporation pellets	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658
OAI contact aligner	OAI	200	UV photolithography
Octadecanethiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Orbital shaker	VWR	89032-088
Phosphate buffered saline (PBS)	Research product international	P32080-100T
Polydimethylsiloxane Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Silicon Wafer	University Wafer	ID#809
Sodium pyruvate	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Titanium evaporation pellets	International Advanced Materials	TI14
Transparency mask (with feature)	Outputicity.com	N/A	Mask printing service
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo fisher scientific	25200-072