Поглощение дозы воздействия соединений на основе платины и рутения у рыбок данио с помощью масс-спектрометрии индуктивно связанной плазмы с более широким применением

Резюме

Повышенная скорость фармако- и токсикокинетического анализа металлов и соединений на основе металлов у рыбок данио может быть полезна для экологических и клинических трансляционных исследований. Ограничение неизвестного поглощения воздействия воды было преодолено путем проведения анализа следов металлов на переваренной ткани рыбок данио с использованием масс-спектрометрии индуктивно связанной плазмы.

Аннотация

Металлы и соединения на их основе содержат разнообразные фармакоактивные и токсикологические ксенобиотики. От токсичности тяжелых металлов до химиотерапии, токсикокинетика этих соединений имеет как историческое, так и современное значение. Рыбки данио стали привлекательным модельным организмом в выяснении фармако- и токсикокинетики в исследованиях воздействия окружающей среды и клинических трансляций. Хотя исследования рыбок данио имеют преимущество в том, что они имеют более высокую пропускную способность, чем модели грызунов, существует несколько существенных ограничений для модели.

Одно из таких ограничений присуще режиму дозирования на водной основе. Концентрации воды из этих исследований не могут быть экстраполированы для обеспечения надежных внутренних доз. Прямые измерения соединений на основе металлов позволяют лучше коррелировать с молекулярными и биологическими реакциями, связанными с соединениями. Чтобы преодолеть это ограничение для металлов и соединений на основе металлов, был разработан метод переваривания ткани личинок рыбок данио после воздействия и количественной оценки концентраций металлов в образцах тканей с помощью масс-спектрометрии индуктивно связанной плазмы (ICPMS).

Методы ICPMS были использованы для определения металлических концентраций платины (Pt) из цисплатина и рутения (Ru) из нескольких новых химиотерапевтических препаратов на основе Ru в ткани рыбок данио. Кроме того, этот протокол различал концентрации Pt, которые были изолированы в хорионе личинки по сравнению с тканью рыбки данио. Эти результаты показывают, что этот метод может быть применен для количественного определения дозы металла, присутствующего в тканях личинок. Кроме того, этот способ может быть скорректирован для идентификации конкретных металлов или соединений на основе металлов в широком диапазоне исследований воздействия и дозирования.

Введение

Металлы и соединения на их основе по-прежнему имеют фармакологическое и токсикологическое значение. Распространенность воздействия тяжелых металлов и его влияние на здоровье экспоненциально увеличили научные исследования с 1960-х годов и достигли рекордно высокого уровня в 2021 году. Концентрации тяжелых металлов в питьевой воде, загрязнение воздуха и профессиональное воздействие превышают нормативные пределы во всем мире и остаются проблемой для мышьяка, кадмия, ртути, хрома, свинца и других металлов. Новые методы количественной оценки воздействия окружающей среды и анализа патологического развития по-прежнему пользуются большим спросом ^1,2,3.

И наоборот, медицинская область использовала физико-химические свойства различных металлов для клинического лечения. Препараты на основе металлов или металлопрепараты имеют богатую историю лечебных целей и показали активность против целого ряда заболеваний, с наибольшим успехом в качестве химиотерапевтических^{средств 4}. Самый известный из металлопрепаратов, цисплатин, является противоопухолевым препаратом на основе Pt, признанным Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) одним из основных лекарств в мире⁵. В 2010 году цисплатин и его производные Pt имели до 90% успеха при нескольких видах рака и использовались примерно в 50% схем химиотерапии ^6,7,8. Хотя химиотерапевтические средства на основе Pt имели неопровержимый успех, токсичность, ограничивающая дозу, привела в движение исследования альтернативных препаратов на основе металлов с рафинированной биологической доставкой и активностью. Из этих альтернатив соединения на основе Ru стали самыми популярными 9,10,11,12.

Новые модели и методология необходимы, чтобы идти в ногу со скоростью потребности в фармако- и токсикокинетических исследованиях металлов. Модель рыбок данио находится на пересечении сложности и пропускной способности, являясь высокоплотным позвоночным с 70% сохраненной гомологией гена¹³. Эта модель была активом в фармакологии и токсикологии, с обширными скринингами для различных соединений для обнаружения свинца, идентификации мишеней и механистической активности 14,15,16,17. Тем не менее, высокопроизводительный скрининг химических веществ обычно зависит от воздействия воды. Учитывая, что поглощение может быть переменным в зависимости от физико-химических свойств соединения в растворе (т.е. фотодеградации, растворимости), это может быть основным ограничением корреляции дозы доставки и ответа.

Чтобы преодолеть это ограничение для сравнения дозы с более высокими позвоночными, была разработана методология анализа концентраций следов металлов в ткани личинок рыбок данио. Здесь кривые «доза-реакция» летальных и сублетальных конечных точек были оценены для цисплатина и новых противоопухолевых соединений на основе Ru. Летальность и задержка вылупления оценивались для номинальных концентраций 0, 3,75, 7,5, 15, 30 и 60 мг/л цисплатина. Накопление Pt в тканях организма было определено анализом ICPMS, и поглощение организмом соответствующих доз составило 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 и 461,9 нг (Pt) на организм. Кроме того, личинки рыбок данио подвергались воздействию 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 мг/л PMC79. Эти концентрации были аналитически определены как содержащие 0, 0,17, 0,44, 0,66 и 0,76 мг/л Ru. Этот протокол также позволил различать концентрации Pt, секвестрированного в хорионе личинок, по сравнению с тканью рыбок данио. Эта методология смогла предоставить надежные, надежные данные для сравнения фармако- и токсикокинетической активности между хорошо зарекомендовавшим себя химиотерапевтическим и новым соединением. Этот метод может быть применен к широкому спектру металлов и соединений на их основе.

протокол

Штамм данио AB (Danio rerio) использовался для всех экспериментов (см. Таблицу материалов), а протокол животноводства (No 08-025) был одобрен Комитетом по уходу за животными и учреждениям Университета Рутгерса.

1. Разведение рыбок данио

1. Разводите и поддерживайте рыбок данио в рециркуляционной системе водной среды обитания в 14-часовом светлом: 10-часовом темном цикле.
   1. Очистите муниципальную водопроводную воду с помощью песка и угольной фильтрации для получения воды в рыбной системе. Поддерживайте воду водной системы при температуре 28 °C, <0,05 ppm нитрита, <0,2 ppm аммиака и pH между 7,2 и 7,7.
   2. Кормите рыбок данио диетой из вылупившихся цист артемии, рассолом креветок и рыбьей диетической чешуйчатой пищей.

2. Протокол доза-реакция рыбок данио (рисунок 1)

1. Приготовьте яичный водный раствор рыбок данио, либо среду E3, либо яичную воду, изготовленную из запасной морской соли в концентрации 60 мкг/мл, растворенную в деионизированной воде¹⁸. Избегайте использования метиленового синего.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью ICPMS изобарическая интерференция яичной воды рыбок данио была идентифицирована для оксидов стронция, которые перекрывались изотопом рутения. Тщательное промывание личинок перед последующим анализом улучшило эту проблему. Среда E3 может быть более легким выбором для некоторых из-за запатентованного состава коммерческих морских солей.
2. Растворите металл или соединения на их основе в Е3 или яичной воде. Вихрь для разрушения любого заполнителя материала и гомогенизации раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В эксперименте, описанном ниже, PMC79 и цисплатин растворяли в максимальных концентрациях 12,4 мг/л и 60 мг/л с максимальной концентрацией 0,5% диметилсульфоксида (ДМСО), чтобы противостоять осаждению.
   1. Разбавляют тяжелые металлы или соединения на основе металлов, такие как PMC79 и цисплатин, Е3 или яичной водой, получая по меньшей мере 5 доз концентрации.
      1. Начинают с низких концентраций стоковых растворов в чистом носителе (т.е. ДМСО), затем разбавляют Е3 или яичной водой. Тщательно рассмотрите конечные концентрации транспортного средства.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые соединения на основе металлов, такие как цисплатин, быстро разлагаются, и их растворы должны ежедневно обновляться. ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с тяжелыми металлами и химиотерапевтическими препаратами с осторожностью. Просмотрите конкретный паспорт безопасности материала (MSDS) для интересующего металла. Цисплатин может вызвать раздражение глаз и кожи, быть смертельным при проглатывании и может вызвать токсичность в почках, крови, кроветворных органах и тканях плода. Избегайте дыхания испарений и контакта с глазами, кожей и одеждой. Носите непроницаемые перчатки и одежду, а также защитные очки или очки¹⁹.
3. Установите резервуары для размножения во второй половине дня перед экспериментом в идеальном соотношении 2 самок на 1 самца с разделителем на месте между полами²⁰.
   1. Потяните за разделитель, когда загорится свет для утреннего цикла.
   2. Позвольте рыбкам данио размножаться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени для разведения зависит от требуемой начальной стадии воздействия. В течение 3 ч после оплодотворения допускайте размножение в течение примерно 2 ч. Яйца достигнут 3 л.с. после очистки и сегрегации яиц.
   3. Переместите размножающуюся рыбу в чистый аквариум.
   4. Соберите яйца, вылив воду из резервуара через ситечко.
   5. Переверните ситечко над чашкой Петри и используйте бутылку с брызгами, наполненную E3 или яичной водой, чтобы промыть яйца в чашку.
   6. Очистите тарелку от пищи и отходов перед экспериментальным использованием.
4. Рандомизируйте примерно двадцать 3 эмбрионов hpf на дозу в отдельные стеклянные флаконы, используя переносную пипетку и небольшое количество воды.
5. После того, как все эмбрионы окажутся во флаконах, удалите всю яичную воду и замените достаточным количеством дозирующего раствора, чтобы над высотой яйца было примерно на 1 дюйм раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует тщательно рассмотреть необходимость дехорионации. Более подробную информацию см. в разделе обсуждения.
6. Ежедневно наблюдайте за эмбрионами на предмет поражений или летальности. Из-за быстрого развития эмбриональных рыбок данио, получайте ежедневные изображения с помощью любого яркого микроскопа / камеры для выявления незначительных поражений между днями.
7. По окончании дозового ответа (через 4-5 дней после оплодотворения [dpf], согласно руководящим принципам²¹ Организации экономического сотрудничества и развития [ОЭСР]), объедините 3-5 личинок перед эвтаназией для композитного отбора проб. Усыпление путем быстрого охлаждения путем мгновенного замораживания в жидком азоте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия через передозировку MS-222 или трикаина метансульфоната может потенциально помешать анализу ICPMS в дальнейшем. Методы быстроохлаждающей эвтаназии рекомендуются для этого протокола, чтобы уменьшить возможность вмешательства.
8. Проведите 3 промывания тканей водой высокой чистоты (например, обратным осмосом) для удаления лишнего соединения с внешней стороны ткани.
9. Переместите образцы в кислото- и микроволновые безопасные 15 мл полипропиленовые центрифужные трубки. Будьте осторожны, чтобы удалить всю лишнюю воду , так как любая оставшаяся жидкость может разбавить азотную кислоту и, следовательно, окислительный потенциал кислоты во время деградации тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ткань может храниться при -20 °C до дальнейшего анализа. Для металлов с естественным изобилием очистка трубок в 5% азотной кислотной ванне перед использованием улучшит фоновые уровни окружающей среды.

3. Сбраживание тканей и оценка ICPMS (рисунок 2)

1. Добавьте приблизительно 0,25 мл в 15 мл полипропиленовых центрифужных пробирок для 10 личинок (~100 мкг) азотной кислоты высокой чистоты (69%). Ультразвук в течение 1 ч для предварительного переваривания образцов с использованием следующих настроек: мощность ультразвуковой ванны: 85 Вт; 42 кГц ± 6%; температурный диапазон: 19-27 °C.
   ВНИМАНИЕ: Носите защиту ушей во время обработки ультразвуком. Азотная кислота вызывает серьезные ожоги дыхательных путей, глаз и кожи. Носите полное защитное снаряжение и работайте в вытяжном шкафу или в местах с достаточной вентиляцией. Он может быть легковоспламеняющимся с другими материалами. Азотная кислота должна обрабатываться исключительно в вытяжке, чтобы предотвратить воздействие паров, образующихся во время пищеварения. Не вдыхайте и не глотайте.
   1. Выполняйте короткие циклы переваривания тканей (интервалы 5 минут) в кислотно-безопасном микроволновом реакторе до тех пор, пока вся ткань не будет заметно окислена (т. Е. Однородный, прозрачно-желтый раствор).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроволновый протокол в таблице 1 рекомендуется выполнять три раза и включает 5-минутный интервал охлаждения между каждым этапом нагрева.
   2. Тщательно контролируйте целостность труб, чтобы избежать разрыва, и проводите короткие вращения в центрифуге (313 × г в течение 1 мин) между циклами, чтобы переместить кислотную конденсацию на дно трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань трудно усваивается (особенно хорионы), 30% перекись водорода высокой чистоты может быть использована после кислотного переваривания. Используйте перекись водорода (6,75 мл), чтобы разбавить концентрацию кислоты до 3,5%, и дайте образцам посидеть на ночь в вытяжке. Перекись водорода разлагается до_H2Oи подходит для анализа ICPMS. Кроме того, альтернативные металлы могут лучше растворяться в соляной кислоте или смеси соляной кислоты и азотной кислоты (т.е. aqua regia). Перекись водорода вредна при проглатывании и вызывает серьезные повреждения глаз. Носите средства защиты кожи и глаз ^22,23.
2. Как только ткань будет заметно окислена (т.е. однородный, прозрачно-желтый раствор), разбавьте образцы в вытяжке до 3,5% азотной кислоты, используя 6,75 мл воды высокой чистоты и вихря для тщательного перемешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при комнатной температуре. Этот шаг не нужен, если перекись водорода была добавлена для облегчения пищеварения на этапе 3.1.
3. Проведите матричную 7-точечную калибровочную кривую (диапазон концентраций 0,001-10 ppb) с использованием сертифицированного элементарного стандарта (т.е. Pt или Ru, в зависимости от анализа) с интересующим металлом и оптимальным изотопом (изотопами) для учета любых потенциальных изобарических интерференций.
   1. Используя запасную концентрацию водного, сертифицированного элементарного стандарта (Ru, Pt = 1000 ppb), возьмите аликвоту 0,1 мл и пипетируйте в новую 15-литровую центрифужную трубку. Разбавляют 3,5% азотной кислотой до конечного объема 10 мл для получения стандартного раствора 10 ppb.
   2. Используя запас 10 ppb, делают следующие последовательные разведения: 0,1, 1,0 и 5,0 ppb стандартных растворов в 3,5% азотной кислоте.
   3. Используя запас 0,1, делают следующие последовательные разведения: 0,001, 0,005 и 0,01 ppb стандартных растворов в 3,5% азотной кислоте.
4. Подготовка инструмента ICPMS (см. Таблица материалов) для анализа проб следующим образом:
   1. Перед запуском прибора убедитесь, что клапан аргонового газа открыт, вся трубка надежно подключена, а чистая 5% азотная кислота открыта для промывки трубок и стеклянной посуды между анализами образцов.
   2. Проверьте состояние горелки и конусов и убедитесь, что коробка горелки надежно заперта, а дренажная трубка распылительной камеры правильно подключена к перипу.
   3. Откройте программное обеспечение (см. Таблицу материалов).
   4. Проверьте показания вакуума и убедитесь, что все турбонасосы работают на 100%.
   5. Нажмите кнопку ПУСК в окне Состояние системы управления плазмой , чтобы инициировать последовательность запуска, включить плазменный насос, плазменный чиллер, продуть небулайзер и зажечь плазму. Подождите, пока плазма загорится и стабилизируется, когда окно состояния покажет, что последовательность запуска завершена. На этом этапе обратите внимание на зеленые точки в окне Состояние системы , которые указывают на то, что все блоки питания включены.
   6. В строке меню выберите Управление | автосэмплера в раскрывающемся меню. Введите положение стойки автопробоотборника для трубки, содержащей 5% азотной кислоты. Позвольте кислоте проникнуть в плазму.
   7. В строке меню нажмите на Сканы | Магнит в выпадающем меню. В окне MagnetScan введите 115 в поле Положение массы маркера и нажмите кнопку ВВОД. Позвольте магниту сканировать в диапазоне масс в течение ¹¹⁵В (от 114,6083 до 115,3749) в течение 30 минут, пока инструмент нагревается.
   8. Через 30 минут используйте элемент управления автоподборником, чтобы перейти в положение многоэлементного решения для настройки 1 ppb. Аспирируйте решение настройки и настройте прибор для оптимизации считывания сигнала. Отрегулируйте положение горелки (X, Y, Z) таким образом, чтобы горелка была выровнена с центром конусов и расходом небулайзера (~ 30 фунтов на кв. дюйм) в окне управления плазмой . Внесите необходимые изменения в окне Настройка ионной оптики для источника, детектора и анализатора.
   9. После оптимизации показаний сигнала (~1,2 × 10⁶ отсчетов/с для 1 ppb на ¹¹⁵вкл)) нажмите кнопку «Стоп» в окне «Сканирование магнита ».
      1. Нажмите «Калибровать магнит» и выберите «Низкое разрешение » во всплывающем окне.
      2. Нажмите OK и откройте файл "Mass Calibration (Low Resolution).smc" для калибровки магнита.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка магнита измеряет количество/с и устанавливает кривую в следующем диапазоне масс: от ⁷Li до ²³⁸U.
      3. Нажмите Сохранить | Используется для применения калибровки токового магнита к анализам. При измерении неизвестных образцов с огромным диапазоном концентраций выполните калибровку детектора для сравнения сигналов подсчета ионных импульсов при низких концентрациях с ослабленными ионными сигналами, полученными при более высоких концентрациях. Проанализируйте образцы после завершения настройки и калибровки.
   10. В строке меню выберите Сбор данных.
       1. Нажмите настройка метода в раскрывающемся меню. Используйте существующий метод, предоставленный производителем, или создайте метод на основе интересующих элементов. При необходимости отрегулируйте режим анализа, время ожидания, задержку переключения, количество разверток/циклов, разрешение, режим обнаружения и парковую массу для настроек дефлектора.
       2. Нажмите кнопку Сохранить , чтобы записать параметры метода. Оптимизируйте параметры для каждого металла и изотопа. Конкретные параметры работы, используемые в данном исследовании, см. в таблице 2 .
   11. В строке меню выберите Сбор данных.
       1. Нажмите на Пакетный запуск в раскрывающемся меню. Кроме того, нажмите на значок BATCH под строкой меню. Импортируйте параметры пакета из электронной таблицы или создайте последовательность в окне Пакетный запуск . Введите тип образца, положение стойки автоподборщика, время передачи, время стирки, реплики, идентификатор образца и файл метода.
   12. Организуйте серийный запуск в следующем порядке: стандартные растворы для калибровочной кривой (0,001-10 ppb Pt или Ru), затем стандарт контроля качества, затем неизвестные образцы.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные решения измеряются как количество/ы на ICPMS, и линейная регрессия соответствует стандартам с относительным стандартным отклонением (RSD) > 0,999. Неизвестные также измеряются как количество/с и решаются для концентрации в ppb с использованием линейной регрессии калибровочной кривой, y = mx + b. Обработка данных также может быть завершена с использованием указанного программного обеспечения.
   13. Мониторинг дрейфа прибора и воспроизводимости образцов путем включения стандарта контроля качества 0,5 ppb каждые 5-10 образцов.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящими стандартами контроля качества должен быть сертифицированный стандартный эталонный материал, отличный от стандарта, используемого в калибровочной кривой.

Мощность в ваттах	Сила	Протокол
300	50%	5
300	75%	5
300	0%	5
300	75%	5

Таблица 1: Протокол микроволнового сбраживания для массы ткани личинки. Образцы личинок рыбок данио переваривали в 0,25 мл азотной кислоты. Эта таблица была изменена с ²⁴.

Результаты

Таких результатов ранее было опубликовано²⁴. Исследования поглощения тканей проводились с воздействием цисплатина на водной основе и нового противоопухолевого соединения на основе Ru, PMC79. Летальность и задержка вылупления оценивались для номинальных концентраций циспла?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, был реализован для определения доставки и поглощения противоопухолевых препаратов на основе металлов, содержащих либо Pt, либо Ru. Хотя эти методы уже были опубликованы, в этом протоколе обсуждаются важные соображения и детали для адаптации этой методологии дл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB Strain Zebrafish (Danio reri)	Zebrafish International Resource Center	Wild-Type AB	Wild-Type AB Zebrafish
ACS Grade Nitric Acid	VWR BDH Chemicals	BDH3130-2.5LP	Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes
Aquatox Fish Diet (Flake)	Zeigler Bros, Inc.		Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Artemia cysts, brine shrimp	PentairAES	BS90	Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed
ASX-510 Autosampler for ICPMS	Teledyne CETAC		Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses.
Centrifuge	Thermo Scientific	CL 2	Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention
Centrifuge tubes	VWR	21008-105	Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom
Class A Clear Glass Threaded Vials	Fisherbrand	03-339-25B	Individual glass vials for exposure containment
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D8418	Solvent or vehicle for hydrophobic compounds
Fixed Speed Vortex Mixer	VWR	10153-834	Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution
High Purity Hydrogen Peroxide	Merk KGaA, EDM Millipore	1.07298.0250	Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion
High Purity Nitric Acid	EDM Millipore	NX0408-2	Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion
Instant Ocean Sea Salt	Spectrum Brands, Inc.	Instant Ocean® Sea Salt	Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml
Mars X Microwave Digestion System	CEM, Matthews, NC		Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W).
Multi-element Solution 3	SPEX CertiPREP	CLMS-3	Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses
Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS)	Nu Instruments/Amatek		Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software.
Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140	National Institute of Standards and Technology	3140	Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses
Platinum (Pt) standard solution, single-element	High Purity Standards	100040-2	Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl
Ruthenium (Ru) standard solution, single-element	High Purity Standards	100046-2	Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	77101	Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Trace Metal Grade Nitric Acid	VWR BDH Chemicals	87003-261	Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler
Ultrasonic water bath	VWR	B2500A-DTH	Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion