Assorbimento della dose dell'esposizione a composti a base di platino e rutenio in Zebrafish mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente con applicazioni più ampie

Riepilogo

L'aumento del tasso di analisi farmaco-e tossicocinetiche di metalli e composti a base di metalli nel pesce zebra può essere vantaggioso per gli studi di traduzione ambientale e clinica. La limitazione dell'assorbimento sconosciuto dell'esposizione all'acqua è stata superata conducendo analisi di metalli in tracce su tessuto zebrafish digerito utilizzando la spettrometria di massa al plasma accoppiata induttivamente.

Abstract

I metalli e i composti a base di metalli comprendono molteplici xenobiotici farmacoattivi e tossicologici. Dalla tossicità dei metalli pesanti ai chemioterapici, la tossicocinetica di questi composti ha rilevanza sia storica che moderna. I pesci zebra sono diventati un organismo modello attraente nel chiarire la farmacocinetica e la tossicocinetica negli studi di esposizione ambientale e traduzione clinica. Sebbene gli studi sui pesci zebra abbiano il vantaggio di avere un rendimento più elevato rispetto ai modelli di roditori, ci sono diversi vincoli significativi al modello.

Una di queste limitazioni è inerente al regime di dosaggio a base acquosa. Le concentrazioni di acqua da questi studi non possono essere estrapolate per fornire dosaggi interni affidabili. Le misurazioni dirette dei composti a base di metalli consentono una migliore correlazione con le risposte molecolari e biologiche correlate ai composti. Per superare questa limitazione per i metalli e i composti a base di metalli, è stata sviluppata una tecnica per digerire il tessuto larvale del pesce zebra dopo l'esposizione e quantificare le concentrazioni di metalli all'interno dei campioni di tessuto mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICPMS).

I metodi ICPMS sono stati utilizzati per determinare le concentrazioni metalliche di platino (Pt) da cisplatino e rutenio (Ru) da diversi nuovi chemioterapici a base di Ru nel tessuto zebrafish. Inoltre, questo protocollo distingueva le concentrazioni di Pt che venivano sequestrate nel coro della larva rispetto al tessuto del pesce zebra. Questi risultati indicano che questo metodo può essere applicato per quantificare la dose di metallo presente nei tessuti larvali. Inoltre, questo metodo può essere adattato per identificare metalli specifici o composti a base di metalli in una vasta gamma di studi di esposizione e dosaggio.

Introduzione

I metalli e i composti a base di metalli continuano ad avere rilevanza farmacologica e tossicologica. La prevalenza dell'esposizione ai metalli pesanti e il suo impatto sulla salute hanno aumentato esponenzialmente le indagini scientifiche dal 1960 e hanno raggiunto il massimo storico nel 2021. Le concentrazioni di metalli pesanti nell'acqua potabile, nell'inquinamento atmosferico e nell'esposizione professionale superano i limiti normativi in tutto il mondo e rimangono un problema per arsenico, cadmio, mercurio, cromo, piombo e altri metalli. Nuovi metodi per quantificare l'esposizione ambientale e analizzare lo sviluppo patologico continuano ad essere molto richiesti ^1,2,3.

Al contrario, il campo medico ha sfruttato le proprietà fisiochimiche di vari metalli per il trattamento clinico. I farmaci a base di metalli o metallofarmaci hanno una ricca storia di scopi medicinali e hanno mostrato attività contro una serie di malattie, con il più alto successo come chemioterapici⁴. Il più famoso dei metallofarmaci, il cisplatino, è un farmaco antitumorale a base di Pt considerato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come uno dei farmaci essenziali del mondo⁵. Nel 2010, il cisplatino e i suoi derivati del Pt hanno avuto un tasso di successo fino al 90% in diversi tumori e sono stati utilizzati in circa il 50% dei regimi^{chemioterapici 6,7,8}. Sebbene i chemioterapici a base di Pt abbiano avuto un successo inconfutabile, la tossicità dose-limitante ha messo in moto indagini su farmaci alternativi a base di metalli con somministrazione e attività biologica raffinata. Di queste alternative, i composti a base di Ru sono diventati i più popolari 9,10,11,12.

Sono necessari nuovi modelli e metodologie per tenere il passo con il tasso di necessità di studi di farmacocinetica e tossicocinetica sui metalli. Il modello del pesce zebra si trova all'intersezione tra complessità e produttività, essendo un vertebrato ad alta fecondità con il 70% di omologia genica conservata¹³. Questo modello è stato una risorsa in farmacologia e tossicologia, con ampi screening per vari composti per la scoperta di piombo, l'identificazione del bersaglio e l'attività meccanicistica 14,15,16,17. Tuttavia, lo screening ad alta produttività delle sostanze chimiche si basa in genere sulle esposizioni trasmesse dall'acqua. Dato che l'assorbimento può essere variabile in base alle proprietà fisico-chimiche del composto in soluzione (cioè fotodegradazione, solubilità), questo può essere un importante limite di correlazione tra l'erogazione della dose e la risposta.

Per superare questa limitazione per il confronto della dose con i vertebrati superiori, è stata progettata una metodologia per analizzare le concentrazioni di metalli in tracce nel tessuto larvale del pesce zebra. Qui, le curve dose-risposta degli endpoint letali e subletali sono state valutate per il cisplatino e nuovi composti antitumorali a base di Ru. La letalità e la schiusa ritardata sono state valutate per concentrazioni nominali di 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L di cisplatino. L'accumulo di Pt nel tessuto dell'organismo è stato determinato dall'analisi ICPMS e l'assorbimento da parte dell'organismo delle rispettive dosi è stato di 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 ng (Pt) per organismo. Inoltre, le larve di zebrafish sono state esposte a 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg / L di PMC79. Queste concentrazioni sono state determinate analiticamente per contenere 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 mg/ L di Ru. Questo protocollo consentiva anche la distinzione delle concentrazioni di Pt sequestrate nel coro delle larve rispetto al tessuto del pesce zebra. Questa metodologia è stata in grado di fornire dati affidabili e solidi per il confronto dell'attività farmaco-tossicocinetica tra un chemioterapico ben consolidato e un nuovo composto. Questo metodo può essere applicato a una vasta gamma di metalli e composti a base di metalli.

Protocollo

Il pesce zebra del ceppo AB (Danio rerio) è stato utilizzato per tutti gli esperimenti (vedi la Tabella dei materiali) e il protocollo di allevamento (# 08-025) è stato approvato dal Comitato per la cura e le strutture degli animali della Rutgers University.

1. Allevamento di pesci zebra

1. Allevare e mantenere il pesce zebra in un sistema di habitat acquatico a ricircolo su un ciclo buio di 14 ore di luce: 10 ore.
   1. Purificare l'acqua del rubinetto comunale attraverso la filtrazione a sabbia e carbone per ottenere acqua del sistema ittico. Mantenere l'acqua del sistema acquatico a 28 °C, < 0,05 ppm di nitrito, <0,2 ppm di ammoniaca e pH compreso tra 7,2 e 7,7.
   2. Dai da mangiare al pesce zebra una dieta di cisti di Artemia tratteggiate, gamberetti in salamoia e cibo in scaglie di pesce.

2. Protocollo dose-risposta zebrafish (Figura 1)

1. Preparare la soluzione di acqua all'uovo di zebrafish, e acqua media E3 o acqua di uova a base di sale marino stock ad una concentrazione di 60 μg/ mL disciolta in acqua deionizzata¹⁸. Evitare l'uso del blu di metilene.
   NOTA: Attraverso iCPMS, è stata identificata l'interferenza isobarica dell'acqua dell'uovo di zebrafish per gli ossidi di stronzio, che si sovrapponevano a un isotopo del rutenio. Un attento risciacquo delle larve prima dell'analisi a valle ha migliorato questo problema. Il mezzo E3 può essere una scelta più facile per alcuni a causa della composizione proprietaria dei sali marini commerciali.
2. Sciogliere il metallo o i composti a base di metallo in E3 o acqua di uovo. Vortice per rompere qualsiasi materiale aggregato e omogeneizzare la soluzione.
   NOTA: Nell'esperimento descritto di seguito, PMC79 e cisplatino sono stati disciolti a concentrazioni massime di 12,4 mg / L e 60 mg / L con una concentrazione massima dello 0,5% di dimetilsolfossido (DMSO) per resistere alle precipitazioni.
   1. Diluire i metalli pesanti o i composti a base di metalli, come PMC79 e cisplatino, con E3 o acqua di uova, preparando almeno 5 dosi di concentrazione.
      1. Iniziare con basse concentrazioni di soluzioni stock in veicoli puri (ad esempio, DMSO), quindi diluire con E3 o acqua di uova. Considerare attentamente le concentrazioni finali del veicolo.
         NOTA: alcuni composti a base di metalli, come il cisplatino, si degradano rapidamente e le loro soluzioni devono essere rese fresche ogni giorno. ATTENZIONE: Maneggiare con cura metalli pesanti e chemioterapici. Rivedere la scheda di dati di sicurezza dei materiali specifici (MSDS) per il metallo di interesse. Il cisplatino può causare irritazione agli occhi e alla pelle, essere fatale se ingerito e può causare tossicità nei reni, nel sangue, negli organi che formano il sangue e nel tessuto fetale. Evitare di respirare fumi e contatto con occhi, pelle e vestiti. Indossare guanti e indumenti impermeabili e occhiali di sicurezza o occhiali¹⁹.
3. Allestire vasche di riproduzione il pomeriggio prima dell'esperimento nel rapporto ideale di 2 femmine per 1 maschio con un divisore in posizione tra i sessi²⁰.
   1. Tirare il divisorio quando le luci si accendono per il ciclo mattutino.
   2. Lascia che il pesce zebra si riproduca.
      NOTA: Il periodo di tempo per la riproduzione dipende dalla fase iniziale di esposizione richiesta. Per 3 ore di postfertilizzazione, consentire l'allevamento per circa 2 ore. Le uova raggiungeranno i 3 hpf dopo la pulizia e la segregazione delle uova.
   3. Spostare il pesce da riproduzione in un serbatoio pulito.
   4. Raccogliere le uova versando l'acqua del serbatoio attraverso un colino.
   5. Capovolgere il colino su una capsula di Petri e utilizzare una bottiglia di schizzo piena di acqua E3 o uovo per sciacquare le uova nel piatto.
   6. Pulire il piatto di cibo e rifiuti prima dell'uso sperimentale.
4. Randomizzare circa venti embrioni da 3 hpf per dose in singole fiale di vetro utilizzando una pipetta di trasferimento e una piccola quantità di acqua.
5. Dopo che tutti gli embrioni sono in fiale, rimuovere tutta l'acqua dell'uovo e sostituire con una soluzione dosatrice sufficiente in modo che ci sia circa 1 pollice di soluzione sopra l'altezza dell'uovo.
   NOTA: La necessità della deconionezione deve essere attentamente considerata. Vedere la sezione di discussione per maggiori dettagli.
6. Osservare gli embrioni ogni giorno per lesioni o letalità. A causa del rapido sviluppo del pesce zebra embrionale, ottenere immagini giornaliere utilizzando qualsiasi microscopio a campo luminoso / configurazione della fotocamera per identificare lesioni minori tra i giorni.
7. Al termine della risposta alla dose (4-5 giorni dopo la fecondazione [dpf], secondo le linee guida²¹ dell'Organizzazione per la Cooperazione e lo Sviluppo Economico [OCSE], combinare 3-5 larve prima dell'eutanasia per il campionamento composito. Eutanasia mediante raffreddamento rapido mediante congelamento a scatto in azoto liquido.
   NOTA: L'eutanasia attraverso un sovradosaggio di MS-222 o tricaina metanosolfonato può potenzialmente interferire con l'analisi ICPMS a valle. I metodi di eutanasia a raffreddamento rapido sono incoraggiati per questo protocollo per ridurre la possibilità di interferenze.
8. Condurre 3 lavaggi di tessuto con acqua ad alta purezza (come l'osmosi inversa) per rimuovere il composto in eccesso dall'esterno del tessuto.
9. Spostare i campioni in tubi centrifughi in polipropilene da 15 mL sicuri per acidi e microonde. Fare attenzione a rimuovere tutta l'acqua in eccesso poiché qualsiasi liquido rimanente può diluire l'acido nitrico e, quindi, il potenziale ossidante dell'acido durante la degradazione dei tessuti.
   NOTA: A questo punto, il tessuto può essere conservato a -20 °C fino a ulteriori analisi. Per i metalli naturalmente abbondanti, la pulizia dei tubi in un bagno di acido nitrico al 5% prima dell'uso migliorerà i livelli di fondo ambientali.

3. Digestione dei tessuti e valutazione ICPMS (Figura 2)

1. Aggiungere circa 0,25 ml ai tubi della centrifuga in polipropilene da 15 mL per un massimo di 10 larve (~100 μg) di acido nitrico ad alta purezza (69%). Ultrasuoni per 1 ora per predigerizzare i campioni utilizzando le seguenti impostazioni: uscita bagno ad ultrasuoni: 85 W; 42 kHz ± 6%; intervallo di temperatura: 19-27 °C.
   ATTENZIONE: Indossare protezioni per le orecchie durante la sonicazione. L'acido nitrico provoca gravi ustioni alle vie respiratorie, agli occhi e alla pelle. Indossare dispositivi di protezione completi e lavorare nella cappa aspirante o in luoghi con adeguata ventilazione. Può essere infiammabile con altri materiali. L'acido nitrico deve essere maneggiato esclusivamente in una cappa aspirante per evitare l'esposizione ai vapori prodotti durante la digestione. Non inalare o ingerire.
   1. Eseguire brevi cicli di digestione dei tessuti (intervalli di 5 minuti) in un digestore a microonde sicuro per gli acidi fino a quando tutto il tessuto è visibilmente ossidato (cioè una soluzione uniforme, giallo chiaro).
      NOTA: si consiglia di eseguire il protocollo a microonde nella Tabella 1 tre volte e include un intervallo di raffreddamento di 5 minuti tra ogni fase di riscaldamento.
   2. Monitorare attentamente l'integrità dei tubi per evitare rotture e condurre brevi giri nella centrifuga (313 × g per 1 min) tra i cicli per spostare la condensa acida sul fondo del tubo.
      NOTA: Se il tessuto è difficile da digerire (in particolare i cori), il 30% di perossido di idrogeno ad alta purezza può essere utilizzato dopo la digestione acida. Utilizzare il perossido di idrogeno (6,75 ml) per diluire la concentrazione di acido al 3,5% e consentire ai campioni di sedersi durante la notte in una cappa aspirante. Il perossido di idrogeno si decompone a H₂O ed è adatto per l'analisi ICPMS. Inoltre, i metalli alternativi possono dissolversi meglio nell'acido cloridrico o in una miscela di acido cloridrico e acido nitrico (cioè aqua regia). Il perossido di idrogeno è dannoso se ingerito e provoca gravi danni agli occhi. Indossare la protezione della pelle e degli occhi^22,23.
2. Una volta che il tessuto è visibilmente ossidato (cioè una soluzione uniforme, giallo chiaro), diluire i campioni in una cappa aspirante al 3,5% di acido nitrico usando 6,75 ml di acqua ad alta purezza e vortice per mescolare accuratamente.
   NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente. Questo passaggio non è necessario se il perossido di idrogeno è stato aggiunto per aiutare la digestione nel passaggio 3.1.
3. Condurre una curva di calibrazione a 7 punti abbinata alla matrice (intervallo di concentrazione di 0,001-10 ppb) utilizzando uno standard elementare certificato (ad esempio, Pt o Ru, a seconda del test) con il metallo di interesse e isotopi ottimali per tenere conto di eventuali potenziali interferenze isobariche.
   1. Utilizzando una concentrazione di riserva dello standard elementare acquoso e certificato (Ru, Pt = 1000 ppb), prelevare un'aliquota e un pipetto da 0,1 mL in un nuovo tubo centrifugo da 15 mL. Diluire con acido nitrico al 3,5% fino a un volume finale di 10 ml per produrre una soluzione standard da 10 ppb.
   2. Utilizzando lo stock da 10 ppb, effettuare le seguenti diluizioni seriali: soluzioni standard da 0,1, 1,0 e 5,0 ppb in acido nitrico al 3,5%.
   3. Utilizzando lo stock 0.1, effettuare le seguenti diluizioni seriali: 0,001, 0,005 e 0,01 ppb soluzioni standard in acido nitrico al 3,5%.
4. Preparare lo strumento ICPMS (vedere il Tabella dei materiali) per l'analisi del campione come segue:
   1. Prima di avviare lo strumento, assicurarsi che la valvola del gas Argon sia aperta, che tutti i tubi siano collegati saldamente e che l'acido nitrico pulito al 5% sia aperto per il risciacquo di tubi e bicchieri tra le analisi dei campioni.
   2. Controllare le condizioni della torcia e dei coni e assicurarsi che la scatola della torcia sia saldamente bloccata e che il tubo di drenaggio della camera di spruzzatura sia collegato correttamente alla peripompa.
   3. Aprire il software (vedere la Tabella dei materiali).
   4. Controllare le letture del vuoto e assicurarsi che tutte le turbopompe funzionino al 100%.
   5. Fare clic su START nella finestra Stato del sistema di controllo al plasma per avviare la sequenza di avvio, accendere la pompa al plasma, il refrigeratore al plasma, eliminare il nebulizzatore e accendere il plasma. Attendere che il plasma sia acceso e stabile quando la finestra di stato indicherà che la sequenza di avvio è completa. A questo punto, osserva i punti verdi nella finestra Stato del sistema che indicano che tutti gli alimentatori sono accesi.
   6. Nella barra dei menu, fai clic su Controlla |ampionatore automatico nel menu a discesa. Inserire la posizione del rack dell'autocampionatore per il tubo contenente il 5% di acido nitrico. Lasciare che l'acido entri nel plasma.
   7. Nella barra dei menu, fare clic su Scansioni | Magnete nel menu a discesa. Nella finestra MagnetScan , digitare 115 nella posizione di massa del marcatore e fare clic su Invio. Consentire al magnete di eseguire la scansione in tutto l'intervallo di massa per ¹¹⁵in (da 114,6083 a 115,3749) per 30 minuti mentre lo strumento si riscalda.
   8. Dopo 30 minuti, utilizzare il controllo dell'autocampionatore per spostarsi nella posizione di una soluzione di sintonizzazione multielemento da 1 ppb. Aspirare la soluzione di accordatura e sintonizzare lo strumento per ottimizzare la lettura del segnale. Regolare la posizione della torcia (X, Y, Z) in modo che la torcia sia allineata con il centro dei coni e la portata del nebulizzatore (~ 30 psi) nella finestra di controllo al plasma . Effettuare le regolazioni necessarie nella finestra Sintonizzazione ottica ionica per sorgente, rilevatore e analizzatore.
   9. Una volta ottimizzata la lettura del segnale (~1,2 × 10⁶ conteggi/s per 1 ppb su ¹¹⁵In), fare clic su Stop nella finestra Scansione magnete .
      1. Fare clic su Calibra magnete e selezionare Bassa risoluzione nella finestra popup.
      2. Fare clic su OK e aprire il file "Calibrazione di massa (bassa risoluzione).smc" per calibrare il magnete.
         NOTA: la calibrazione del magnete misurerà i conteggi e calpesterà una curva attraverso il seguente intervallo di massa: da ⁷Li a ²³⁸U.
      3. Fai clic su Salva | Utilizzare per applicare la calibrazione del magnete corrente alle analisi. Se si misurano campioni sconosciuti con una vasta gamma di concentrazioni, eseguire una calibrazione del rilevatore per confrontare i segnali di conteggio degli impulsi ionici a basse concentrazioni con segnali ionici attenuati prodotti a concentrazioni più elevate. Analizzare i campioni una volta completata la messa a punto e la calibrazione.
   10. Nella barra dei menu, fare clic su Acquisizione dati.
       1. Fare clic su Impostazione metodo nel menu a discesa. Utilizzare un metodo esistente fornito dal produttore o creare un metodo basato sugli elementi di interesse. Se necessario, regolare la modalità di analisi, il tempo di permanenza, il ritardo dell'interruttore, il numero di sweep/cicli, la risoluzione, la modalità di rilevamento e la massa del parco per le impostazioni del deflettore.
       2. Fare clic su Salva per registrare le impostazioni del metodo. Ottimizzare i parametri per ogni metallo e isotopo. Vedere la Tabella 2 per i parametri operativi specifici utilizzati in questo studio.
   11. Nella barra dei menu, fare clic su Acquisizione dati.
       1. Fare clic su Esecuzione batch nel menu a discesa. In alternativa, fare clic sull'icona BATCH sotto la barra dei menu. Importare i parametri batch da un foglio di calcolo o creare una sequenza nella finestra Esecuzione batch . Immettere il tipo di campione, la posizione del rack dell'autocampionatore, il tempo di trasferimento, il tempo di lavaggio, le repliche, l'ID campione e il file di metodo.
   12. Disporre l'esecuzione del lotto nel seguente ordine: soluzioni standard per la curva di calibrazione (0,001-10 ppb Pt o Ru), seguite da uno standard di controllo qualità, quindi campioni sconosciuti.
       NOTA: le soluzioni standard sono misurate come conteggi sull'ICPMS e una regressione lineare è adatta attraverso gli standard con una deviazione standard relativa (RSD) > 0,999. Le incognite sono anche misurate come conteggi e risolte per la concentrazione in ppb usando la regressione lineare della curva di calibrazione, y = mx + b. L'elaborazione dei dati può essere completata anche utilizzando il software di riferimento.
   13. Monitorare la deriva dello strumento e la riproducibilità del campione includendo uno standard di controllo qualità di 0,5 ppb ogni 5-10 campioni.
       NOTA: gli standard di controllo qualità adeguati devono essere un materiale di riferimento standard certificato diverso dallo standard utilizzato nella curva di calibrazione.

Watt	Potenza	Verbale
300	50%	5
300	75%	5
300	0%	5
300	75%	5

Tabella 1: Protocollo di digestione a microonde per la massa del tessuto larvale. I campioni larvali di zebrafish sono stati digeriti in 0,25 ml di acido nitrico. Questa tabella è stata modificata da ²⁴.

Risultati

Questi risultati sono stati precedentemente pubblicati²⁴. Sono stati condotti studi sull'assorbimento dei tessuti con esposizioni trasmesse dall'acqua di cisplatino e un nuovo composto antitumorale a base di Ru, PMC79. La letalità e la schiusa ritardata sono state valutate per le concentrazioni nominali di cisplatino 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L di cisplatino. L'accumulo di Pt nel tessuto dell'organismo è stato determinato mediante analisi ICPMS e il tessuto dell'organismo conteneva le rispett...

Discussione

Il protocollo qui descritto è stato implementato per determinare la somministrazione e l'assorbimento di farmaci antitumorali a base di metalli contenenti Pt o Ru. Sebbene questi metodi siano già stati pubblicati, questo protocollo discute importanti considerazioni e dettagli per adattare questa metodologia a una serie di composti. Il protocollo OCSE abbinato alla digestione dei tessuti e all'analisi ICPMS ci ha permesso di determinare che il PMC79 era più potente del cisplatino e ha provocato un accumulo di tessuto d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB Strain Zebrafish (Danio reri)	Zebrafish International Resource Center	Wild-Type AB	Wild-Type AB Zebrafish
ACS Grade Nitric Acid	VWR BDH Chemicals	BDH3130-2.5LP	Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes
Aquatox Fish Diet (Flake)	Zeigler Bros, Inc.		Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Artemia cysts, brine shrimp	PentairAES	BS90	Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed
ASX-510 Autosampler for ICPMS	Teledyne CETAC		Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses.
Centrifuge	Thermo Scientific	CL 2	Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention
Centrifuge tubes	VWR	21008-105	Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom
Class A Clear Glass Threaded Vials	Fisherbrand	03-339-25B	Individual glass vials for exposure containment
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D8418	Solvent or vehicle for hydrophobic compounds
Fixed Speed Vortex Mixer	VWR	10153-834	Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution
High Purity Hydrogen Peroxide	Merk KGaA, EDM Millipore	1.07298.0250	Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion
High Purity Nitric Acid	EDM Millipore	NX0408-2	Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion
Instant Ocean Sea Salt	Spectrum Brands, Inc.	Instant Ocean® Sea Salt	Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml
Mars X Microwave Digestion System	CEM, Matthews, NC		Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W).
Multi-element Solution 3	SPEX CertiPREP	CLMS-3	Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses
Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS)	Nu Instruments/Amatek		Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software.
Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140	National Institute of Standards and Technology	3140	Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses
Platinum (Pt) standard solution, single-element	High Purity Standards	100040-2	Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl
Ruthenium (Ru) standard solution, single-element	High Purity Standards	100046-2	Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	77101	Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Trace Metal Grade Nitric Acid	VWR BDH Chemicals	87003-261	Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler
Ultrasonic water bath	VWR	B2500A-DTH	Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion