В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Продемонстрирован высокоскоростной ультрафиолетовый фотоакустический микроскоп с открытым верхом, который может предоставлять гистологические изображения интраоперационно для хирургического анализа полей, включая конфигурацию системы, оптическое выравнивание, подготовку образцов и экспериментальные процедуры.

Аннотация

Хирургический анализ маржи (СМА), необходимая процедура для подтверждения полного иссечения раковой ткани в хирургии резекции опухоли, требует интраоперационных диагностических инструментов, чтобы избежать повторных операций из-за положительного хирургического края. Недавно, используя преимущества высокого внутреннего оптического поглощения ДНК / РНК на длине волны 266 нм, была разработана ультрафиолетовая фотоакустическая микроскопия (UV-PAM) для обеспечения гистологических изображений высокого разрешения без маркировки, показывая большие перспективы в качестве интраоперационного инструмента для СМА. Чтобы обеспечить возможность разработки UV-PAM для SMA, здесь представлена высокоскоростная и открытая система UV-PAM, которая может работать аналогично обычным оптическим микроскопиям. Система UV-PAM обеспечивает высокое боковое разрешение 1,2 мкм и высокую скорость изображения 55 кГц A-line с одноосевым сканированием зеркала гальванометра. Кроме того, чтобы изображения UV-PAM могли быть легко интерпретированы патологоанатомами без дополнительной подготовки, оригинальные изображения UV-PAM в оттенках серого практически окрашиваются алгоритмом глубокого обучения, чтобы имитировать стандартные изображения, окрашенные гематоксилином и эозином, что позволяет проводить гистологический анализ без обучения. Визуализация среза мозга мыши выполняется для демонстрации высокой производительности системы UV-PAM с открытым верхом, иллюстрируя ее большой потенциал для приложений SMA.

Введение

Хирургический анализ краев (СМА), который требует исследования образцов тканей под микроскопом, является важной процедурой для определения того, все ли раковые клетки удаляются из тела пациента в резекционной хирургии1. Поэтому микроскоп, который может быстро предоставлять гистологические изображения, жизненно важен для СМА, чтобы избежать повторных операций, вызванных неполным удалением раковых клеток. Однако, согласно текущему методу золотого стандарта, основанному на оптической микроскопии яркого поля, иссеченную ткань необходимо зафиксировать в формалине, внедрить в парафин, разрезать на тонкие срезы (4-7 мкм), а затем окрасить гематоксилином и эозином (H&E) перед визуализацией, что является трудоемким (3-7 дней) и трудоемким 2,3 . Замороженный участок является быстрой альтернативой СМА путем быстрого замораживания, нарезки и окрашивания ткани, что может обеспечить гистологические изображения за 20-30 мин4. Однако гистологические особенности часто искажаются и требуются умелые тренировки, что затрудняет применимость методики к нескольким типам органов5.

Методы оптической микроскопии, которые могут обеспечить клеточные изображения без или с несколькими этапами обработки тканей, были разработаны для СМА. Однако каждый из них страдает от разных проблем. Например, оптическая когерентная томография6 и конфокальная отражательная микроскопия7 страдают низкой специфичностью из-за их низкой внутренней контрастности рассеяния. Хотя микроскопия с ультрафиолетовым возбуждением поверхности8 и светоплотная микроскопия9 могут обеспечить изображения с высоким разрешением и высокой контрастностью для СМА, процедура токсичного и летучего окрашивания обычно не может быть выполнена в операционной, что продлевает время обработки. Многофотонная микроскопия10 и стимулированная рамановская микроскопия11 могут предоставить богатую информацию для СМА. Тем не менее, высокая стоимость необходимых сверхбыстрых лазеров, которые используются для генерации нелинейных эффектов, препятствует их широкой применимости.

Недавно, используя преимущества собственного оптического поглощения, была разработана ультрафиолетовая фотоакустическая микроскопия без меток (UV-PAM) для обеспечения гистологических изображений высокого разрешения12. В UV-PAM энергия фотонов УФ-излучения возбуждения (например, 266 нм) сначала поглощается ДНК/РНК в ядрах клеток13 , а затем преобразуется в тепло, индуцируя излучение акустической волны через термоупругий разложение14. Путем обнаружения генерируемых акустических волн двумерные (2D) UV-PAM изображения ядер клеток могут быть получены с помощью проекции максимальной амплитуды акустических сигналов, обеспечивая гистологическую информацию для СМА. Для обеспечения клинического применения UV-PAM был разработан высокоскоростной UV-PAM на основе сканирования зеркал гальванометра для предоставления гистологических изображений для образца биопсии мозга (5 мм х 5 мм) в течение 18 мин, демонстрируя большой потенциал в чувствительных ко времени приложениях15. Для дальнейшего подтверждения возможности UV-PAM для визуализации толстых тканей была предложена система UV-PAM в режиме отражения с водонепроницаемым одноосевым сканером микроэлектромеханических систем, успешно демонстрирующая интраоперационное гистопатологическое исследование тканей толстой кишки и печени человека16. Поскольку исходное изображение UV-PAM выполнено в оттенках серого, в то время как изображение золотого стандарта H&E окрашено в розовые и фиолетовые цвета, патологоанатомам трудно интерпретировать изображения UV-PAM напрямую. Для решения этой проблемы был предложен алгоритм глубокого обучения для передачи изображений UV-PAM оттенков серого в виртуальные изображения, окрашенные H&E, почти в режиме реального времени, чтобы патологоанатомы могли понять изображения без какой-либо дополнительной подготовки17.

В этой работе сообщается о высокоскоростной и открытой системе UV-PAM, которая может работать аналогично обычным оптическим микроскопиям, предоставляя как оригинальные гистологические изображения в оттенках серого, так и виртуально окрашенные изображения с помощью алгоритма глубокого обучения. Срез мозга мыши с фиксацией формалина и парафином (FFPE) визуализируется системой UV-PAM, чтобы продемонстрировать сходство между нашими практически окрашенными UV-PAM и стандартными изображениями, окрашенными H & E, показывая его потенциал для применения СМА.

протокол

Все эксперименты на животных, выполненные в этой работе, одобрены Комитетом по этике животных в Гонконгском университете науки и технологии.

1. Система UV-PAM с открытым верхом (рисунок 1)

  1. Оптическая подсветка
    1. Используйте твердотельный лазер с диодной накачкой Q-switch (длина волны 266 нм) в качестве источника возбуждения.
    2. Используйте две выпуклые линзы для расширения лазерного луча и поместите точечное отверстие близко к фокусной точке первой выпуклой линзы для выполнения пространственной фильтрации.
    3. Отражайте лазерный луч вверх с помощью 1D-зеркала гальванометра (1D GM).
    4. Используйте объектив для фокусировки лазерного луча и прохождения через центр кольцеобразного ультразвукового преобразователя (UT), прежде чем быть плотно сфокусированным на образце.
  2. Ультразвуковое обнаружение
    1. Используйте кольцеобразный сфокусированный UT для обнаружения ультразвуковых волн. Внутренний и наружный диаметры активной области UT составляют 3 мм и 6 мм соответственно. Фокусное расстояние: 6.3 mm; центральная частота: 40 МГц; Полоса пропускания -6 дБ: 84%.
    2. Закрепите UT в лабораторном резервуаре для воды с оптически прозрачным окном внизу, покрытым тонким кварцевым чехлом, чтобы пропускать ультрафиолетовый свет. Убедитесь, что активная область UT обращена вверх. Прикрепите резервуар для воды к двухосевой ручной ступени для управления боковым положением UT.
    3. Включите УФ-лазер, отрегулируйте положение UT, чтобы лазерный луч проходил от центра UT. Выключите УФ-лазер. Затем заполните резервуар для воды деионизированной водой, чтобы полностью погрузить UT.
    4. Подключите выход UT к двум усилителям (суммарный коэффициент усиления = 56 дБ) и подключите выход второго усилителя к карте сбора данных (DAQ).
  3. Прикрепите держатель образца к ручной ступени по оси Z, которая соединена с xy-моторизованными ступенями. Держатель образца имеет пустое отверстие, которое пропускает ультрафиолетовый свет. Прикрепите четыре куска двусторонней ленты, окружающей отверстие.
  4. Выравнивание системы
    1. Прикрепите черную ленту к стеклянному слайду и поместите стеклянную заслонку, чтобы покрыть отверстие держателя образца, а черную ленту повернуть вниз. Нажмите на стеклянный слайд, чтобы убедиться, что он закреплен на держателе образца. Затем опустите держатель образца, чтобы погрузить стекло в воду.
    2. Отсоедините кольцеобразный UT и усилители, подключите UT к импульсу/приемнику и подключите выход импульса/приемника к осциллографу. Переведите импульс/приемник в режим Pulse-Echo. Установите амплитуду импульса и коэффициент усиления импульса/приемника на 6 и 20 дБ соответственно.
      1. Включите импульс/приемник и отрегулируйте z-положение держателя образца, чтобы найти положение акустической фокальной плоскости, где ультразвуковые сигналы максимальны.
    3. Переключите импульс/приемник в режим передачи и установите коэффициент усиления на 60 дБ. Включите лазерный выход. Отрегулируйте z-положение объектива, чтобы максимизировать сигналы ПА, измеряемые осциллографом.
    4. Отрегулируйте боковое положение кольцеобразного UT, чтобы сделать генерируемый сигнал ПА симметричным и максимальным, что означает, что оптический и акустический фокусы объединены в боковой плоскости. Затем отрегулируйте z-положение держателя образца, чтобы максимизировать сигналы PA.
    5. Повторите шаги 1.4.3 и 1.4.4 для оптимизации симметрии и амплитуды сигналов ПА. Запишите временную задержку (т.е. время, необходимое для того, чтобы волны ПА достигли UT) на осциллографе, когда сигналы ПА оптимизированы.
    6. Переместите держатель образца в различные положения черной ленты. Отрегулируйте плоскостность держателя образца таким образом, чтобы сигналы ПА, генерируемые из каждого положения черной ленты, имели такую же временную задержку, как и измеренная на этапе 1.4.5.
    7. Выключите лазер и подключите UT к двум усилителям.

2. Пробоподготовка

  1. Срез мозга мыши FFPE
    1. Приносят в жертву мышь при передозировке анестезии. Затем соберите мозг мыши в соответствии с протоколом, описанным в ссылке18.
    2. Зафиксируйте собранный мозг в 10% нейтральном буферизованном формалине в течение 24 ч.
    3. Обработать неподвижный мозг путем обезвоживания градуированным спиртом, очистки ксилолом и встраивания парафином, как описано в ссылке19.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте образец в вытяжном шкафу.
    4. Нарежьте встроенный мозг тонкими ломтиками (толщиной 5 мкм) с помощью микротома. Поместите срезы образца на кварцевые слайды. Высушите горки в духовке при 60 °C в течение 1 ч.
    5. Депарафинизируйте участки с помощью очищающего агента (см. Таблицу материалов), который удаляет парафин, чтобы избежать высоких фоновых сигналов, поскольку парафин сильно поглощается при УФ-возбуждении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте образец в вытяжном шкафу.
  2. Свежий срез мозга мыши
    1. Приносят в жертву мышь при передозировке анестезии. Затем соберите мозг мыши в соответствии с протоколом, указанным в ссылке18.
    2. Промыть мозг мыши фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления крови.
    3. Вырежьте кусочек образца мозга (толщиной ~ 5 мм) вручную, а затем промыте образец PBS, чтобы удалить кровь на поперечном сечении.

3. Экспериментальные процедуры

  1. Размещение образцов
    1. Подготовьте лабораторный резервуар для образцов с прозрачной УФ-мембраной (полиэтилен, толщина ∼10 мкм). Добавьте каплю воды к мембране, а затем поместите биологический образец в резервуар для образцов, чтобы покрыть воду. В случае образца среза FFPE используйте ленту для фиксации стеклянного слайда на мембране.
    2. Поместите резервуар для проб, содержащий образец, на держатель для образцов, обеспечив закрытие пустого отверстия держателя для образцов.
  2. Установите УФ-лазер в режим внешнего триггера. С помощью нашей лабораторной программы LabVIEW (см. Таблицу материалов) задайте параметры сканирования следующим образом.
    1. Установить частоту повторения лазера на 55 кГц; установить тип сигналаe драйвера GM на треугольный , а диапазон напряжения привода на 0,018 В (представляющий ±0,018 В; коэффициент масштабирования: 1 В/°). Установите GMnum на 22 и dy на 2 так, чтобы после каждых 22 лазерных триггеров GM заканчивал четверть периода сканирования, а двигатель по оси Y перемещал шаг размером 0,3125 мкм. Установите dx равным 192 таким образом, чтобы, когда двигатель по оси Y достигает заданного положения (например, 5 мм), двигатель по оси X перемещался с шагом 30 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наименьший размер шага приращения установлен равным 0,15625 мкм для двигателей по осям x и y. Поэтому, когда dy = 2, размер шага равен 0,15625 x 2 = 0,3125 мкм, а когда dx = 192, размер шага равен 0,15625 x 192 = 30 мкм. Чтобы отсканировать всю площадь 5 х 5мм2, двигатель оси X будет перемещаться на 5000 мкм / 30 мкм = 167 раз, что означает, что для получения целого изображения будет сшито 167 подизображений. На рисунке 2 показана траектория сканирования системы UV-PAM.
  3. Начните пробное сканирование на небольшой области, установив количество движущихся шагов двигателей по осям x и y (xn = 10 и yn = 1000). Отрегулируйте ручной каскад по оси Z, чтобы поместить образец на фокальную плоскость для получения максимальных сигналов PA.
  4. Переместите двигатели по осям x и y в нужную начальную точку, задайте область сканирования, установив значения xn и yn , а затем запустите программу получения изображений (см. Таблицу материалов).
  5. После получения изображения выключите лазер, извлеките держатель образца и сохраните биологические образцы.
  6. Для свежих биологических тканей храните образцы в 10% нейтральном буферизованном формалине.
  7. Для срезов мозга мыши FFPE окрашивают H&E в соответствии с протоколом, указанным в ссылке20 , для получения соответствующих изображений, окрашенных H&E.
  8. Используйте собранные сигналы ПА для реконструкции максимального амплитудного проекционного изображения с использованием лабораторного алгоритма обработки изображений (см. Таблицу материалов).

Результаты

На рисунке 1 показана схема высокоскоростной системы UV-PAM. В этой установке пути оптического возбуждения и ультразвукового обнаружения находятся на одной стороне и ниже образца, образуя отражающий режим и систему с открытым верхом. Таким образом, он удобен для пользователя и подходит для визуализации толстых образцов.

На рисунке 2 показана траектория сканирования системы UV-PAM во время визуализации. Подизображение каждого участка (например, площадь 5 мм х 30 мкм) сначала генерируется с использованием алгоритма рассеянной интерполяции, а затем получается целое изображение (например, площадь 5 мм х 5 мм) путем сшивания всех подизображений с использованием пользовательского алгоритма обработки изображений (см. Таблицу материалов).

На рисунках 3A и 3B показаны изображения UV-PAM и H&E среза мозга мыши FFPE соответственно, оба из которых имеют поле зрения 5 x 5 мм2. Доступ к алгоритму обработки изображений можно получить с Github по ссылке, указанной в Таблице материалов. Время получения изображения составило менее 18 мин. На рисунке 3C-F показаны увеличенные изображения отмеченных областей на рисунке 3A, где отдельные ядра клеток могут быть четко разрешены. Что еще более важно, соответствующие ядра клеток можно найти на стандартных изображениях, окрашенных H&E (рисунок 3G-J), показывающих высокую точность текущей системы для клеточной визуализации. Для переноса изображения UV-PAM в оттенках серого на виртуальное изображение, окрашенное В&Э, был применен алгоритмглубокого обучения 17 (см. Таблицу материалов), который занял бы менее 30 с для изображения с разрешением 8000 x 8000 пикселей. Соответствующие увеличенные изображения показаны на рисунке 3K-N. Практически окрашенные изображения UV-PAM предоставляют почти ту же структурную информацию, что и изображения, окрашенные H & E, показывая перспективу для клинического перевода текущей системы UV-PAM.

figure-results-2469
Рисунок 1: Схема высокоскоростной и открытой системы UV-PAM. (A) Настройка системы. (B) Фотография держателя образца и резервуара для воды, который прикреплен к двухосевой ручной ступени. С) Фотография кольцеобразного ультразвукового преобразователя, закрепленного в резервуаре для воды, и резервуара для проб, закрывающего отверстие держателя образца. D) фотография цистерны для образцов с мембраной и образцом, которая будет помещена на держатель образца. УФ: Ультрафиолет; DAQ: Карта сбора данных; ГМ: Зеркало гальванометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3441
Рисунок 2: Траектория сканирования системы UV-PAM во время визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3873
Рисунок 3: Экспериментальные результаты визуализации UV-PAM с виртуальным окрашиванием на основе глубокого обучения. (A) UV-PAM изображение среза мозга мыши FFPE. (B) Стандартное H&E-окрашенное изображение одного и того же среза. Шкалы масштаба: 1 мм. (C-F) Увеличенные изображения отмеченных областей в A. (Г-Дж) Соответствующие H&E-окрашенные изображения отмеченных областей в B. (К-Н) Соответствующие виртуально окрашенные изображения с помощью алгоритма глубокого обучения. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Таким образом, высокоскоростная система UV-PAM с открытым верхом была продемонстрирована для гистологической визуализации. Представлены подробные инструкции по конфигурации системы, оптическому выравниванию, пробоподготовке и экспериментальным процедурам. Доступ к программе получения изображений можно получить с Github по ссылке, указанной в Таблице материалов. Боковое разрешение настоящей системы составляет ~1,2 мкм, что было экспериментально измерено в недавней публикации21. Срез мозга мыши был сфотографирован, чтобы продемонстрировать, что настоящая система может получить гистологическое изображение в течение 18 мин для области 5 х 5мм2, что является типичным размером биопсии мозга22. Хотя исходное изображение находится в оттенках серого, с помощью цифрового инструмента виртуального окрашивания, поддерживаемого алгоритмом глубокого обучения, настоящая система может дополнительно предоставлять виртуально окрашенные изображения почти в режиме реального времени, обеспечивая легкую адаптацию для патологоанатомов для интерпретации изображений. В качестве метода изображения без меток настоящая система UV-PAM может также предоставлять гистологические изображения для необработанных образцов свежих тканей. Другие примеры (включая замороженные и свежие образцы тканей) были продемонстрированы в предыдущей публикации17. Экспериментальные результаты показывают высокий потенциал существующей системы UV-PAM с поддержкой глубокого обучения в приложениях СМА.

Одним из преимуществ системы UV-PAM является то, что система реализована в режиме отражения, что позволяет визуализировать толстые ткани. Кроме того, система UV-PAM с открытым верхом позволяет размещать образец на сканирующем окне (мембране резервуара для образцов), которое имеет аналогичную операцию, как и традиционные оптические микроскопии. Поэтому эта система более удобна для пользователя, чем другие системы, которые требуют, чтобы образцы были зажаты двумя мембранами11,14. Кроме того, используя 1D GM с высокой частотой повторения УФ-лазера, настоящая система UV-PAM может достичь высокой скорости визуализации с более высокой экономической эффективностью по сравнению с системой, использующей мультифокальное возбуждение23.

В настоящее время скорость изображения в основном ограничена частотой повторения лазерного и фотонного бюджета. С лазером, который имеет высокую частоту повторения и высокую энергию импульса, время визуализации может быть еще больше сокращено. Другим ограничением системы является то, что образец может быть только приблизительно отрегулирован к фокальной плоскости объектива путем нахождения максимальных сигналов PA, вместо отображения изображения в реальном времени для пользователей, чтобы визуализировать, находится ли образец в фокусе. Для отображения изображения, близкого к реальному времени, можно применить 2D GM.

Протокол предусматривает два важнейших этапа: а) конфокальные требования к оптическим и акустическим очагам должны быть оптимизированы для достижения высокой чувствительности обнаружения; b) диапазон сканирования ГМ на оси X должен быть меньше, чем акустическое фокальное пятно кольцеобразного UT, чтобы поддерживать аналогичную высокую чувствительность обнаружения (в текущей конфигурации диапазон сканирования составляет ~30 мкм ±15 мкм). В противном случае очевидные эффекты виньетирования по краям будут возникать, когда несколько подизображений сшиваются вместе, чтобы получить целое изображение.

Раскрытие информации

T.T.W.W. и V.T.C.T. имеют финансовую заинтересованность в PhoMedics Limited, которая, однако, не поддержала эту работу. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность за финансовую поддержку со стороны Комиссии по инновациям и технологиям Гонконга (ITS/036/19).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AlcoholSigma AldrichPHR1373Sample dehydration
AmplifierMini CircuitZFL-500LN-BNC+Ultrasonic signal amplification
ControllerNational InstrumentsNI myRIOSystem controller
Data acquisition cardAlazar TechnologiesATS9350Ultrasonic signal collection
Deep-learning algorithmFor transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM
FormalinSigma AldrichR04586Sample fixation
H&E staining kitAbcamab245880Sample staining
Histo-Clear IINational DiagnosticsHS-202Sample deparaffinization
Image acquisition programNational InstrumentsLabVIEWLab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM
Image processing algorithmMathworksMATLABLab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM
Kinematic platform mountsThorlabsKM200BAdjust the sample to be flat
MembraneGladCling wrapSandwiched in sample tank
Microscope objective lensThorlabsLMU- 5X-NUVObjective lens
Motorized stagesPhysik InstrumenteL-509.10SD00Scanning stages
One-dimensional galvanometer mirrorThorlabsGVS411Fast scanning mirror
OscilloscopeRIGOL TechnologiesDS1102EUltrasonic signal readout
Phosphate-buffered salineSigma AldrichP3813Sample washing
PinholeEdmund Optics#59–257Spatial filtering
Plano convex lensThorlabsLA-4600-UVFocusing lens
Plano convex lensThorlabsLA-4663-UVCollimating lens
Pulser/receiverImaginantDPR300Pulse echo amplifier
Q-switch diode-pumped solid-state laserBright SolutionsWEDGE HF 266 nm266-nm laser
Ring-shaped ultrasonic transducerUniversity of Southern CaliforniaUltrasonic signal detection
Sample holderLab-madeHold the sample tank
Sample tankLab-madeHold biological samples
Single-axis Z-translational stageThorlabsPT1Manual stage
Two-axis manual stageThorlabsLX20Manual stage
Water tankLab-madeUltrasonic signal transmission
XyleneSigma AldrichXX0060Sample clearing

Ссылки

  1. Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
  2. Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
  3. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  4. Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
  5. Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma - a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
  6. Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
  7. Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
  8. Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
  9. Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
  10. Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
  11. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
  12. Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
  13. Shen, C. -. H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
  14. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic microscopy. Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).
  15. Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
  16. Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
  17. Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
  18. . Sterile Tissue Harvest | Protocol Available from: https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022)
  19. . Steps to Tissue Processing for Histopathology Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022)
  20. . An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022)
  21. Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
  22. Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
  23. Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены