Прижизненная микроскопия для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в печени мышей

Резюме

Прижизненная микроскопия является мощным инструментом, который позволяет получить представление о временных и пространственных взаимосвязях быстрых и/или последовательных процессов. В данной работе мы описываем протокол для оценки как белок-белковых взаимодействий, так и тромбоцитарно-нейтрофильно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени на мышиной модели экспериментального сепсиса (эндотоксемии).

Аннотация

Воспаление и тромбоз – это сложные процессы, которые протекают преимущественно в микроциркуляции. Хотя стандартная гистология может дать представление о конечном пути развития как воспаления, так и тромбоза, она не способна показать временные изменения, которые происходят на протяжении всего времени этих процессов. Прижизненная микроскопия (IVM) — это использование визуализации живых животных для получения временного представления о физиологических процессах in vivo. Этот метод особенно эффективен при оценке клеточных и белковых взаимодействий в кровотоке из-за быстрых и последовательных событий, которые часто необходимы для возникновения этих взаимодействий. Несмотря на то, что IVM является чрезвычайно мощной методологией визуализации, способной наблюдать за сложными процессами in vivo, существует ряд методологических факторов, которые важно учитывать при планировании исследования IVM. В этой статье описывается процесс проведения прижизненной визуализации печени, выявляются важные соображения и потенциальные подводные камни, которые могут возникнуть. Таким образом, в данной статье описывается использование IVM для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени с целью изучения относительного вклада каждого из них в различных моделях острого повреждения печени.

Введение

Воспаление и тромбоз – это сложные процессы, которые протекают преимущественно в микроциркуляции. В этом протоколе описывается хирургическая подготовка, которая позволяет визуализировать микроциркуляторное русло печени in vivo. Хотя стандартная гистология может дать представление о конечных путях как воспаления, так и тромбоза, она не может показать временные изменения, которые происходят на протяжении всего процесса. Кроме того, этот метод особенно эффективен при оценке транзиторных клеточных и белковых взаимодействий, происходящих в микрососудистом кровообращении, благодаря его способности фиксировать с помощью видеомикроскопии часто быстрые и последовательные взаимодействия, происходящие в биологических системах. В данной работе описывается использование прижизненной микроскопии для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени с целью изучения относительного вклада каждого из них в различных моделях острого повреждения печени.

В то время как эта хирургическая подготовка и метод визуализации могут быть адаптированы к множеству воспалительных и патологических моделей, здесь описаны две модели сосудистого воспаления: модель эндотоксемии мышиного сепсиса и повреждение печени, вызванное ацетаминофеном (APAP). Инъекции эндотоксина (липополисахарид; ЛПС) для индуцирования экспериментальной модели мышиного сепсиса началась еще в 1930-х годах с его выделения и последующего исследования в качестве ключевой молекулы в прогрессировании сепсиса¹. Несмотря на то, что эта модель ограничена тем, что ЛПС является лишь одним компонентом грамотрицательных бактерий, это широко принятый и используемый метод, который относительно прост и быстр в применении. Кроме того, он быстро и точно воспроизводит физиологические проявления сепсиса¹. Учитывая роль, которую абсорбция эндотоксинов в кишечнике играет в развитии заболеваний печени и воспаления², это превосходная модель для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в печени мышей.

В дополнение к модели сепсиса с помощью ЛПС, передозировка APAP обеспечивает отличную модель для изучения патологических межклеточных взаимодействий в печени. Передозировка APAP может привести к острой печеночной недостаточности, характеризующейся тромбоцитопенией и накоплением тромбоцитов в печени, что впоследствии блокирует опосредованное лейкоцитами восстановление печени³. В то время как хирургическая подготовка и методология визуализации для этой модели могут быть адаптированы для ряда биологических вопросов и для изучения различных патологических процессов, как модель сепсиса ЛПС, так и APAP-индуцированное повреждение печени являются отличными моделями для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий in vivo.

ЭКО имеет некоторые неотъемлемые преимущества по сравнению со стандартными гистологическими методами. В то время как стандартные гистологические методы позволяют изучать целые или срезы тканей и оценивать белки и архитектуру тканей, эти методологии имеют ограничения. По замыслу, эти процессы требуют обработки тканей, которая может исказить или замаскировать то, что находится в живой системе. Ткань должна быть зафиксирована во время гистологического препарирования, что может привести к артефактам фиксации или усилению аутофлуоресценции. Фиксация также может привести к внутриклеточным изменениям в тканях, а потенциальная возможность неправильной фиксации может привести к деградации тканей. Кроме того, гистологические методы не имеют потенциала для непосредственного изучения временных аспектов белковых или клеточных взаимодействий и могут пропускать эфемерные или нечастые взаимодействия.

И наоборот, флуоресцентная прижизненная микроскопия позволяет избежать многих осложнений и ограничений, присущих стандартной гистологии. IVM позволяет избежать фиксации и, тем самым, артефактов или деградации тканей, которые могут произойти во время гистологической подготовки. По своей конструкции он также позволяет визуализировать ткани внутри живой биологической системы, и, таким образом, выделение и разделение тканей не требуются. Кроме того, он позволяет визуализировать и изучать преходящие или редкие процессы, которые может быть трудно или невозможно зафиксировать с помощью гистологии. Этот метод IVM также может быть использован для захвата и идентификации последовательных процессов (например, взаимодействий, инициированных тромбоцитами или лейкоцитами, в результате чего тромбоцитарно-лейкоцитарные агрегаты связываются с эндотелием сосудов). Наконец, этот метод может быть адаптирован к множеству систем визуализации. В зависимости от потребностей исследования и желаемого набора данных, после хирургической подготовки на экстернализованную печень можно установить практически любую желаемую систему визуализации. Мы успешно применили этот протокол для визуализации с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии, микроскопии вращающегося диска, лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с использованием сканера резонансной головки, а также двухфотонной микроскопии. Однако нет никаких оснований полагать, что этот метод должен быть ограничен вышеупомянутыми системами микроскопии.

В этом методе изложен протокол IVM, который ранее использовался для изучения тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в печени мышей. Этот протокол был использован для сравнения височной тромбоцитарно-эндотелиальной адгезии тромбоцитов, либо меченных флуоресцентно конъюгированными антителами, либо генетически модифицированных для эндогенной флуоресценции⁴. Этот протокол был использован для оценки транзиторных тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени в эндотоксемической модели воспаления печени и для совместной локализации P-селектина и рекомбинантного белка. Кроме того, этот протокол позволил определить, являются ли различия в плотности нейтрофилов с помощью стандартной гистологии результатом различий в скоростях эритроцитов (в качестве суррогата объемной скорости потока)⁵. Наконец, этот метод был использован для оценки рекрутирования тромбоцитов клетками Купфера в синусоидах печени в острой модели APAP-индуцированного повреждения печени⁶. Такая работа была бы невозможна при использовании стандартных гистологических методов. Как уже говорилось, этот протокол может быть адаптирован для различных систем визуализации, и при правильной хирургической подготовке, выборе флуоресцентных антител и настройках визуализации этот протокол является высоконадежным и воспроизводимым для изучения патологии печени.

протокол

Все протоколы для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского колледжа Бейлора и Комитетом по исследованиям и разработкам Медицинского центра по делам ветеранов Майкла Э. Дебейки. Все эксперименты являются заключительными, в конце эвтаназии проводится под хирургической плоскостью анестезии. Подробную информацию обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Получение антител и красителей

1. Выбор антител и красителей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество наблюдаемых одновременных цветов будет зависеть от конкретной конфигурации микроскопа. В используемой здесь системе можно визуализировать четыре разные длины волн одновременно.
   1. Визуализация сосудов:
      1. В зависимости от плана эксперимента пометьте сосудистую сеть либо эндотелий-специфичным (например, CD31) антителом, либо молекулой, которая равномерно распределена в плазме (например, декстрана или альбумином).
         ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье описывается использование техасского красного маркированного декстрана (150 кДа; 250 мкг/мышь). Преимущество этого белка с большой молекулярной массой заключается в его способности оставаться в сосудистой сети во время острого воспаления. Необходимо соблюдать осторожность при использовании мечения антител, чтобы избежать антител, которые могут нарушать функцию эндотелия.
   2. Визуализация тромбоцитов:
      1. Для идентификации тромбоцитов используйте либо генетически модифицированные мышей (например, R26R-EYFP^f/f/PF4-Cre), либо тромбоцито-специфические (например, анти-GPIbβ) антитела к IVM. Для получения подробной информации об использовании флуоресцентного мечения тромбоцитов см. предыдущую публикацию⁴.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются меченые DyLight488 антитела против GPIbβ (X488; 6 мкг/мышь). Необходимо соблюдать осторожность при использовании мечения антителами, чтобы избежать нарушения функции тромбоцитов или адгезии.
   3. Визуализация лейкоцитов:
      1. Подобно визуализации тромбоцитов, визуализируйте интересующие вас лейкоциты либо с помощью генетически модифицированных мышей (например, LysM-EGFP для гранулоцитов), либо лейкоцит-специфических антител (например, Ly6G для мышиных нейтрофилов). Чтобы следовать этому протоколу, используйте меченые Brilliant Violet 421 (BV421) антитела против Ly6G (3 мкг/мышь). В экспериментах с острыми тонами (<6 ч) помечают нейтрофилы 3 мкг анти-Ly6G (клон 1A8) на животное.
         Примечание: При использовании антитела против Ly6G (клон 1A8) следует отметить, что это антитело использовалось для истощения нейтрофилов (0,05-1 мг антитела/мышь)^7-9 через не менее 24 ч и/или при повторных инъекциях. Также сообщалось, что антитела Anti-Ly6G (1A8) влияют на адгезию и трансмиграцию нейтрофилов при высоком (но не низком) напряжении сдвига в некоторых, но не во всех ситуациях ^9,10. Поэтому дозировку антител следует тщательно подбирать для каждого случая.
   4. Дополнительные белки:
      1. В зависимости от количества лазеров и наборов фильтров/детекторов, доступных в конкретной системе визуализации, добавьте больше длин волн, чтобы идентифицировать больше объектов одновременно, стараясь при этом избежать наложения спектра.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает визуализацию 4-го объекта, P-селектина (клон Psel.KO2.3), с использованием меченого PerCP-eFluor 710 анти-P-селектинового антитела (4 мкг/мышь). Хотя большинство описаний и изображений в этой статье относятся к острому повреждению печени, вызванному ЛПС, другие модели повреждения могут представлять интерес и могут потребовать альтернативных обозначений. Описание антител, используемых для лечения APAP-индуцированного повреждения см. в обсуждении⁶.
2. Удаление консервантов и стерилизация
   Примечание: Несмотря на то, что существуют коммерчески доступные антитела и красители, готовые для инъекций животным, большинство из них будут содержать носители или консерванты (например, азид натрия), которые могут быть вредны для животных или добавлять искажающие переменные. Антитела и красители, содержащие носители или консерванты, должны быть диализированы против фосфатно-солевого буфера Дульбекко без кальция или магния (DPBS^-/-; или других физиологических буферов).
   1. Налейте 500 мл DPBS^-/- (~1000-кратный объем антитела/красителя, подлежащего диализу) в стакан с магнитной мешалкой. Прикрепите кассету мощностью 7 000 MWCO к поплавковому бую и поместите ее в диализный буфер не менее чем на 5 минут для предварительного кондиционирования мембраны. Извлеките кассету и промокните пластиковые края насухо безворсовой салфеткой. Избегайте прикосновения к диализной мембране.
   2. Введите антитело/краситель в кассету через один из четырех портов с помощью иглы 18-20 G. Поместите кассету с антителом/красителем в диализный буфер. Поместите стакан на магнитную мешалку и диализируйте не менее 1 часа при температуре 4 °C. Смените диализный буфер.
   3. Повторите диализ и замену диализного буфера на шаге 1.2.2 еще как минимум два раза (не менее трех обменов).
   4. Извлеките кассету и промокните пластиковые края насухо безворсовой салфеткой. Избегайте прикосновения к диализной мембране. Аспирируйте антитело/краситель из кассеты через неиспользуемый порт с помощью иглы 18-20 G.
   5. В вытяжке для культуры тканей стерилизуйте препараты с помощью фильтра 0,2 мкм перед использованием у животных. Храните неиспользованные порции в стерильных пробирках при температуре 4 °C.
3. Рычаги управления
   1. В то время как точный контроль, необходимый для каждого эксперимента, будет варьироваться в зависимости от дизайна исследования, обязательно включите надлежащие фиктивные когорты, группы, получавшие и не получавшие носитель, а также контрольные изотипы, чтобы исключить неспецифическую маркировку и биологические эффекты при анализе результатов исследования.

2. Внутрибрюшинное введение эндотоксина

Примечание: Для оценки тромбоцитарно-нейтрофильно-эндотелиальных взаимодействий в синусоидах печени на экспериментальной модели мышиного сепсиса можно использовать инъекции эндотоксина.

1. Взвесьте мышей, чтобы определить количество эндотоксина для введения (5 мг/кг; Escherichia coli серотип O111:B4; содержание эндотоксина 1 х 10⁶ ЕУ/мг).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Активность и эффект эндотоксина зависят от вида и штамма и могут варьироваться от партии^{к партии 11}. Поэтому для максимальной согласованности результатов следует проводить эксперименты с одной и той же партией эндотоксина¹².
2. Наберите эндотоксин, разведенный обычным физиологическим раствором (0,9% хлорида натрия), в шприц с прикрепленной иглой 27 G. В недоминантной руке держите мышь за загривок с помощью большого и указательного пальцев. Используя другую руку, надавите на хвост, чтобы обнажить живот, и поместите хвост между пятым пальцем и ладонью недоминантной руки.
3. Очистите брюшную полость с помощью 70% этанола. Введите иглу в нижнюю левую (или правую) область живота и введите эндотоксин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы не вводить иглу слишком глубоко, потому что существует риск повреждения органов, которое может затруднить проведение экспериментов (например, повреждение кишечника, почек и т. д.).
4. Выполните шаги 2.1-2.3 у контрольных животных с использованием обычного физиологического раствора (или транспортного средства).
   Примечание: APAP-индуцированное повреждение печени может быть достигнуто с использованием методологии, аналогичной описанной выше, с использованием APAP, а не эндотоксина⁶. Подробности о модели APAP-индуцированного повреждения печени см. в обсуждении.

3. Индукция и поддержание анестезии животных и эвтаназия

1. Поместите животных под хирургическую плоскость анестезии. Поддерживайте анестезию с помощью ингаляционного изофлурана через носовой конус или трахеостомическую трубку. Оценивайте и корректируйте уровень анестезии, отслеживая движение после защемления пальца ноги.
2. В конце всех экспериментов проводят эвтаназию путем обескровливания под хирургической плоскостью анестезии с последующим двусторонним пневмотораксом.

4. Катетеризация яремной вены и трахеи

1. Выполните трахеотомию для облегчения дыхания и установки сосудистых катетеров для введения меченых антител/красителей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургический диссекционный микроскоп или лупы полезны при катетеризации.
2. Сбрить шерсть с шеи и живота; удалить лишние волосы. Положите животное на грелку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C, используя ректальный зонд для контроля температуры тела. Потрите шею бетадином, а затем 70% этанолом.
3. Сделайте вертикальный разрез по средней линии на шее и обнажите трахею с помощью тупого рассечения.
   1. Трахеостомия
      1. Подготовьте трахеостомическую трубку PE90 с введенной тупой иглой 21 G (рисунок 1A).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление скоса ~45° к концу трахеостомической трубки может облегчить ее введение в трахею. В качестве альтернативы, периферический внутривенный катетер 18-20 G также может быть заменен на трубку PE90.
      2. После того, как кожа и фасция будут надрезаны, отведите слюнные железы от центра.
      3. С помощью тупой диссекции отделите грудино-щитовидную мышцу, чтобы обеспечить лучший доступ к трахее.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не было питающих сосудов и сонных артерий, которые прилегают к трахее.
      4. Сделайте небольшой (~1-2 мм) горизонтальный разрез между кольцами трахеи на вентральной/передней стороне трахеи (рис. 1B).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ножниц Vannas облегчит правильное препарирование. Следите за тем, чтобы надрез был сделан только на передней поверхности трахеи; Полная транссекция трахеи затруднит канюляцию трахеи и может повредить близлежащие сосудистые структуры.
      5. Введите в отверстие трахеостомическую трубку. Следите за тем, чтобы кончик трубки не вставлялся за киль.
      6. Закрепите трахеостомическую трубку внутри трахеи, завязав шелковый шов #4-0 вокруг трахеи и трубки, используя кольца трахеи в качестве опоры (Рисунок 1C).
   2. Наружная яремная канюляция
      1. Подготовьте яремный катетер (Рисунок 2) с помощью трубки PE50 (внешний диаметр 0,97 мм, внутренний диаметр 0,58 мм) с трубкой PE10 (внешний диаметр 0,61 мм, внутренний диаметр 0,28 мм), вставленной в один конец (вставка Рисунка 2), и тупой иглой 22 G или 23 G, вставленной в другой. Используйте клей, чтобы трубка не скользила и не протекала. Прикрепите шприц, наполненный стерильным физиологическим раствором, чтобы промыть катетер.
      2. Обнажите наружную яремную вену (ЭДВ) после отражения слюнной железы. С помощью тупой диссекции освободите EJV от окружающей соединительной ткани (рис. 3A).
      3. Используя шелковые шовные нити #4-0, перевяжите краниальный конец визуализированной EJV и поместите свободную петлю вокруг каудального конца EJV (Рисунок 3B). Зажмите концы каждого шва вместе с помощью гемостатиков и аккуратно оттяните два гемостата друг от друга, чтобы помочь обнажить EJV.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная область для канюляции находится между ветвями передней яремной вены краниально и внутренней яремной вены каудально. Чтобы облегчить наложение швов, сложите кусок (~15 см) шовной нити пополам и пропустите согнутый конец под EJV с помощью одной пары щипцов, одновременно поднимая EJV с помощью отдельной пары щипцов, чтобы предотвратить скручивание сосуда. Затем разрежьте шов, чтобы получилось две отдельные длины.
      4. С помощью ножниц Vannas сделайте небольшой (~1 мм) разрез на передней поверхности EJV. Введите изогнутую тупую иглу 30 G (дополненную штифтом диаметром 0,15 мм, тупо подпиленным и вставленным в кончик иглы) в EJV через разрез и осторожно поднимите ее вверх, чтобы облегчить прохождение катетера, содержащего нормальный физиологический раствор, в EJV.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением и промывкой в мышь убедитесь, что на катетере и концентраторе нет пузырьков воздуха. Воздушная эмболия может быть смертельной для животного.
      5. Как только катетер окажется внутри EJV, ослабьте каудальную петлю ровно настолько, чтобы катетер мог пройти глубже в вену. Проверьте расположение катетера путем аспирации крови и промывки катетера для проверки на утечки (Рисунок 3C).
      6. С помощью каудальной петли закрепите катетер внутри EJV. С помощью черепного шва закрепите катетер на краниальном конце EJV, чтобы свести к минимуму случайную деканюляцию (рисунок 3D).
      7. Закройте разрез кожи шеи шелковым швом #4-0.

5. Экстериоризация печени

1. Очистите брюшную полость с помощью скраба с бетадином, а затем 70% этанола.
2. Сделайте вертикальный разрез ~1 см на коже верхней части живота, начиная с основания грудины. С помощью тупого рассечения отделите кожу от мышц живота. Прижгите крупные питающие сосуды кожи и мышц, чтобы свести к минимуму кровотечение во время следующих этапов (рисунок 4A).
3. Сделайте горизонтальный разрез кожи на ~1-2 см с последующей мышцей живота, разрезая вертикальный разрез пополам на шаге 5.2 примерно в верхней части видимой печени; использовать инструмент для прижигания для помощи в гемостазе кожи (рисунок 4B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер разреза брюшной полости имеет решающее значение для оптимальной визуализации печени. Если отверстие слишком маленькое, существует риск ишемии печени из-за перерастяжения или ущемления печеночной артерии и/или воротной вены. Если отверстие слишком большое, то другие органы, такие как кишечник, также могут быть выведены наружу и мешать визуализации.
4. Вырежьте примерно 1 см круг в центре марли размером 2 в х 2 и смочите его теплым обычным физиологическим раствором. Расположите марлю так, чтобы отверстие располагалось по центру разреза. Осторожно раздвиньте края разреза и надавите на брюшную полость легким направлением вверх, чтобы наружно обнажить печень, чтобы печень легко лежала поверх увлажненной марли (рисунок 4C).
5. Поместите мышь на лоток для визуализации в положении лежа так, чтобы печень находилась по центру покровного стекла (рисунок 4D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: У контрольного животного печень должна быть темно-бордовой. В этом протоколе для ЭКО используется инвертированный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с двусторонним резонансным головным сканером. Поэтому для создания пользовательского лотка IVM был использован 3D-принтер (рисунок 5). Предоставлены файлы .stl, созданные для 3D-печати (Дополнительный файл 1); Могут потребоваться корректировки в соответствии с индивидуальными потребностями.
6. Перенесите животное в перевернутый микроскоп.

6. Прижизненная микроскопия печени

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с двусторонним резонансным головным сканером для прижизненной микроскопии. Чтобы стабилизировать частоту резонансной головки, включите систему не менее чем за 30 минут до начала визуализации. Разные системы могут иметь разные возможности. Обсуждение этих вопросов выходит за рамки данной статьи. Свяжитесь с представителями оборудования для получения технических подробностей конкретных систем.

1. Чтобы сохранить операционную плоскость анестезии, подключите животное к системе доставки изофлурана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от протокола эксперимента, может потребоваться искусственная вентиляция легких (в отличие от спонтанной вентиляции).
2. Положите на животное лучистящую греющую прокладку, используя ректальный зонд, чтобы поддерживать внутреннюю температуру 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе прямоугольный кусок пенопласта, который подходит для лотка IVM, действует как изолятор и распорка, на которую помещается лучистая прокладка для обогрева (Рисунок 4D).
3. Установите револьверную головку объектива на желаемое увеличение, при необходимости нанося иммерсионное масло. Чтобы следовать этому протоколу, используйте объектив из силиконового масла 60x/NA1.30 с 1-кратным оптическим зумом.
4. После того, как фокальная плоскость определена, определите ≥10 случайных полей зрения, избегая областей вблизи краев печени.
   Примечание: Поскольку печень проявляет аутофлуоресценцию в канале флуоресцеина изотиоцианата (FITC), используйте эпифлуоресценцию для быстрой идентификации общей фокальной плоскости.
   1. В зависимости от системы определите края видимой печени с помощью эпифлуоресценции в канале FITC и запишите координаты стадии (x,y).
   2. Используйте границы печени (x,y) и генератор случайных чисел для определения случайных координат (x,y). Для получения приемлемого поля зрения обратите внимание на (а) наличие судов, рассредоточенных по всему полю зрения; b) ≥80% судов находятся в одной и той же фокальной плоскости; и (c) ≥1 поле зрения от любых краев печени (пример на рисунке 6). Если анализ изображений сосредоточен на тромбоцитарно-лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействиях в печеночных синусоидах, исключите поля с сосудами, диаметр которых составляет ≥15 мкм (диаметр мышиных синусоид обычно составляет ≤10 мкм).

7. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ/FIJI использовался для обработки всех изображений в этой статье. FIJI (fiji.sc) — это версия Image J (imagej.nih.gov) с открытым исходным кодом, которая обладает большей функциональностью за счет использования дополнительных плагинов и макросов¹³.

1. Откройте многоканальные покадровые файлы в ImageJ/FIJI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от платформы, могут потребоваться дополнительные программы/плагины. ImageJ/FIJI имеет импортер биоформатов, который может открывать несколько различных типов файлов, таких как файлы .oir от Olympus. Здесь файлы были преобразованы в .tif, потому что это более широко используемый формат.
2. Убедитесь, что установлен правильный масштаб; Обратите внимание на соотношение пикселей/μм и временной интервал в метаданных/свойствах.
3. Используйте различные фильтры для удаления фонового шума (например, фильтр со срединным радиусом 2 пикселя, используемый в этом протоколе). Убедитесь, что обработка всех изображений одинакова, чтобы свести к минимуму различия при постобработке. По мере сравнения подсчетов и длительности в этих экспериментах вместо средней интенсивности флуоресценции используйте фильтр для улучшения ясности, а также для идентификации и измерения межклеточных взаимодействий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование и величина фильтров будут зависеть от размера интересующей цели (целей) и соотношения сигнал/шум на изображениях.
4. Поскольку существует неоднородность между полями зрения по плотности сосудов, измерьте общую площадь сосудов в каждом поле с помощью кисти выбора (рис. 7).
   1. Щёлкните правой кнопкой мыши по овальному инструменту выделения и выберите инструмент «Кисть выделения ».
   2. Отрегулируйте размер кисти, дважды щелкнув значок инструмента «Кисть выделения ».
   3. Обведите сосуды, чтобы выделить/выбрать их. Чтобы удалить части выделенной области, используйте щелчок [alt] и щелкните левой кнопкой мыши с помощью клавиши [shift] и щелкните левой кнопкой мыши.
   4. Нажмите [M] , чтобы измерить выбранную область.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если масштаб изображения был правильно установлен, то вывод должен быть в μm², который конвертируется в мм².
5. Подсчитайте количество тромбоцитов и лейкоцитов в поле. Считать клетки адгезивными, если они переместились на <1 клеточное тело в течение 30 с. Рассчитайте количество клеток (тромбоцитов и/или лейкоцитов) на мм².
6. Чтобы оценить относительный кровоток в каждом сосуде, измерьте среднюю скорость эритроцитов (RBC) в качестве суррогата с помощью плагина MTrackJ в ImageJ/FIJI (imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)¹⁴, как описано ранее⁵. Идентифицируйте эритроциты как круглые или дискообразные дефекты наполнения в канале декстрана. Сохраняйте треки для ведения учета, асинхронного анализа и проверки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пример этого показан на рисунке 8 и в дополнительном видео S1.

Результаты

Оценка влияния стержневого домена виментина на адгезию лейкоцитов к воспаленному эндотелию
Связывание лейкоцитарного Р-селектина гликопротеина-1 (PSGL-1) с эндотелиальным и тромбоцитарным Р-селектином происходит во время острой фазы воспаления повреждения ...

Обсуждение

Цель данной методики состоит в том, чтобы описать необходимые шаги, необходимые для надежного получения прижизненных изображений и видео печени мыши с высоким разрешением в гомеостатических условиях и после введения эндотоксина или APAP. Несмотря на то, что этот прото?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Supplies
2" x 2" non-woven sponges	McKesson Med. Surg	92242000	For liver isolation
#4-0 silk braided suture with needle	SOFSILK	N/A	4-0 Softsilk coated braided black, nonabsorbable: C-1 cutting needle
#4-0 silk braided suture without needle	Ethicon	N/A	4-0 Black braided silk, nonabsorbable
21 G blunt needle (0.5 inch)	SAI Infusion Technologies	B21-50	This is used to attach to the end of the tracheostomy tube to allow for connection to the ventilator. An alternative source is Instech
23 G blunt needle (0.5 inch)	SAI Infusion Technologies	B23-50	This is used for the vascular catheter to allow for connection to a syringe. An alternative source is Instech
Dissecting Scissors (Pointed Tip)	Kent Scientific	INS600393-G	Micro Dissecting Scissors; Carbide Blades; Straight; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4 1/2" Overall Length
McPherson-Vannas Micro Scissors (Vannas)	Kent Scientific	INS600124	These are useful for creating the openings in the trachea and vessels
Polyethylene tubing 10	Instech	BTPE-10	This is used to make the intravascular portion of the catheter. An alternative source is BD Intramedic
Polyethylene tubing 50	Instech	BTPE-50	This is used to make the extravascular portion of the catheter.  An alternative source is BD Intramedic
Polyethylene tubing 90	Instech	BTPE-90	This is used to make the tracheostomy tube.  An alternative source is BD Intramedic
USP grade sterile normal saline	Coviden	8881570121	Hospira 0.0% Sodium Chloride Injection, USP
Microscopy Supplies
Isoflurane delivery system and ventilator	Kent Scientific	Somnosuite	Combination rodent ventilator and volatile anesthetic delivery system
Foam spacer for warming pad during microscopy	N/A	N/A	This spacer should be cut from high quality foam, should fit around the liver microscope tray and specific height dimensions are dependent upon the microscope system
Laser scanning confocal microscope system with resonance head scanner	Olympus	FV3000	Although we describe the use of an Olympus FV3000 using a resonance head scanner, this protocol with work with most imaging systems
Liver Microscope Tray	N/A	N/A	The liver microscope tray was designed for an inverted microscope
Antibodies & Related Reagents
Brilliant Violet 421/anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127628	3 µg/mouse. To label neutrophils
BV421/F4/80 antibody	BioLegend	123132	0.75 mg/kg. To label Kupffer cells
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium or magnesium	Gibco/ThermoFisher Scientific	14190144	Used as dialysate to remove sodium azide from antibodies
DyLight649/anti-GPIbβ antibody	emfret Analytics	X649	3 µg/mouse. To label platelets
DyLight488/anti-mouse GPIbβ antibody	emfret Analytics	X488	6 µg/mouse. To label platelets
Endotoxin from Escherichia coli serotype O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024	5 mg/kg; Potency of endotoxin may vary from lot to lot. Therefore, the same lot should be used for a series of experiments to minimize variation due to endotoxin lot
PerCP-eFluor 710/anti-mouse P-selectin antibody	Invitrogen	46-0626-82	4 µg/mouse. To label P-selectin
Slide-a-Lyzer 7,000 MWCO cassette	Thermo Scientific	66370	Used to dialyze antibodies to remove sodium azide
Texas Red-labeled dextran	Sigma-Aldrich	T1287	~150 kDa; 250 µg/mouse
TRITC/bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2289	500 µg/mouse. Dilute to a stock concentration of 50 mg/mL (5%) in normal saline. Used to label the vasculature. It may leak into the interstitial space more readily than high molecular weight dextran during inflammation