마우스 간에서 혈소판-백혈구-내피 상호작용을 연구하기 위한 생체 내 현미경 검사

요약

Intravital 현미경 검사는 급속 및/또는 순차적 프로세스의 시간적 및 공간적 관계에 대한 통찰력을 제공하는 강력한 도구입니다. 여기에서는 실험적 패혈증(내독소혈증)의 쥐 모델에서 간 정현파의 단백질-단백질 상호 작용과 혈소판-호중구-내피 상호 작용을 모두 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

염증과 혈전증은 주로 미세순환에서 발생하는 복잡한 과정입니다. 표준 조직학은 염증과 혈전증 모두에 대한 최종 경로에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 이러한 과정의 시간 경과에 걸쳐 발생하는 시간적 변화를 보여줄 수는 없습니다. 생체 내 현미경(IVM)은 생체 내 생리학적 과정에 대한 시간적 통찰력을 얻기 위해 살아있는 동물 이미징을 사용하는 것입니다. 이 방법은 순환 내에서 세포와 단백질의 상호 작용을 평가할 때 특히 강력한데, 이러한 상호 작용이 발생하기 위해 종종 필요한 빠르고 순차적인 사건으로 인해 이러한 상호 작용이 발생하기 때문입니다. IVM은 복잡한 과정을 in vivo로 볼 수 있는 매우 강력한 이미징 방법론이지만, IVM 연구를 계획할 때 고려해야 할 여러 가지 중요한 방법론적 요소가 있습니다. 이 논문은 간의 생체 내 영상 촬영을 수행하는 과정을 간략하게 설명하고, 중요한 고려 사항과 발생할 수 있는 잠재적 위험을 식별합니다. 따라서 이 논문은 IVM을 사용하여 간 정현파에서 혈소판-백혈구-내피 상호작용을 연구하고 급성 간 손상의 다른 모델에서 각각의 상대적 기여도를 연구하는 방법을 설명합니다.

서문

염증과 혈전증은 주로 미세순환에서 발생하는 복잡한 과정입니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 간 미세혈관 구조를 이미징할 수 있는 수술 준비를 간략하게 설명합니다. 표준 조직학은 염증과 혈전증 모두의 최종 경로에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 과정 전반에 걸쳐 발생하는 시간적 변화를 보여줄 수는 없습니다. 또한, 이 방법은 비디오 현미경을 통해 생물학적 시스템 내에서 발생하는 빠르고 순차적인 상호 작용을 캡처할 수 있는 능력으로 인해 미세혈관 순환 내에서 발생하는 일시적인 세포 및 단백질 상호 작용을 평가할 때 특히 강력합니다. 이 논문은 간 정현파에서 혈소판-백혈구-내피 상호작용을 연구하기 위한 생체 내 현미경 사용과 급성 간 손상의 서로 다른 모델에서 각각의 상대적 기여도를 연구하는 방법을 설명합니다.

이 수술 준비 및 영상 기법은 다양한 염증 및 병리학적 모델에 적용될 수 있는 잠재력을 가지고 있지만, 여기에는 쥐 패혈증의 내독소혈증 모델과 아세트아미노펜(APAP)에 의한 간 손상의 두 가지 혈관 염증 모델이 요약되어 있습니다. 내독소(lipopolysaccharide; LPS)는 1930년대 초반에 쥐 패혈증의 실험 모델을 유도하기 시작했으며, 패혈증¹ 진행의 핵심 분자로서 쥐를 분리하고 후속 탐사를 수행했습니다. 이 모델은 LPS가 그람 음성 박테리아의 단일 구성 요소일 뿐이라는 점에서 제한적이지만, 비교적 간단하고 빠르게 수행할 수 있는 널리 허용되고 활용되는 방법입니다. 또한, 패혈증¹의 생리학적 증상을 빠르고 정확하게 복제합니다. 장 내독소 흡수가 간 질환 및 염증 발병에 미치는 역할을 감안할 때², 이는 마우스 간에서 혈소판-백혈구-내피 상호작용을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다.

패혈증의 LPS 모델 외에도 APAP 과다 투여는 간의 병리학적 세포-세포 상호 작용 연구를 위한 훌륭한 모델을 제공합니다. APAP 과다 복용은 혈소판 감소증과 간의 혈소판 축적을 특징으로 하는 급성 간부전을 유발할 수 있으며, 이로 인해 백혈구 매개 간 회복을 차단할 수 있다³. 이 모델에 대한 수술 준비 및 이미징 방법론은 여러 생물학적 질문에 적용하고 다양한 병리학적 과정을 연구할 수 있지만, 패혈증의 LPS 모델과 APAP에 의한 간 손상은 모두 생체 내에서 혈소판-백혈구-내피 상호 작용을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다.

IVM은 표준 조직학 기술에 비해 몇 가지 고유한 장점이 있습니다. 표준 조직학적 방법을 사용하면 전체 또는 절편화된 조직 샘플을 연구하고 단백질 및 조직 구조를 이해할 수 있지만 이러한 방법론에는 한계가 있습니다. 설계상 이러한 프로세스에는 조직 처리가 필요하며, 이는 살아있는 시스템에서 발견되는 것을 왜곡하거나 가릴 가능성이 있습니다. 조직은 조직학적 준비 중에 고정되어야 하며, 이로 인해 고정 인공물 또는 향상된 자가형광이 발생할 가능성이 있습니다. 고정은 또한 조직의 세포 내 변화로 이어질 수 있으며 부적절한 고정의 가능성은 조직 저하로 이어질 수 있습니다. 또한, 조직학적 방법은 단백질 또는 세포 상호 작용의 시간적 측면을 직접 연구할 수 있는 잠재력이 부족하고 일시적이거나 드문 상호 작용을 놓칠 가능성이 있습니다.

반대로, 형광 생체 내 현미경 검사를 통해 표준 조직학에 내재된 많은 합병증과 한계를 피할 수 있습니다. IVM은 고정을 피하고, 그로 인해 조직학적 준비 중에 발생할 수 있는 인공물 또는 조직 분해를 방지합니다. 설계상 살아있는 생물학적 시스템 내의 조직을 이미징할 수도 있으므로 조직 분리 및 절편이 필요하지 않습니다. 또한 조직학을 사용하여 캡처하기 어렵거나 불가능할 수 있는 일시적이거나 드문 프로세스에 대한 이미징 및 연구를 가능하게 합니다. 이 IVM 방법은 순차적 프로세스(예: 혈소판 또는 백혈구 시작 상호 작용으로 인해 혈소판-백혈구 응집체가 혈관 내피에 결합됨)를 캡처하고 식별하는 데에도 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 이 방법은 다수의 이미징 시스템에 적용할 수 있습니다. 연구의 필요성과 원하는 데이터 세트에 따라 수술 준비 후 외부화된 간을 원하는 거의 모든 이미징 시스템에 배치할 수 있습니다. 당사는 광시야 형광 현미경, 회전 디스크 현미경, 공명 헤드 스캐너를 사용한 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 및 이광자 현미경을 사용하여 이 프로토콜을 이미징에 성공적으로 적용했습니다. 그러나 이 방법이 앞서 언급한 현미경 시스템으로 제한되어야 한다고 믿을 이유는 없습니다.

이 방법 논문은 이전에 마우스 간에서 혈소판-백혈구-내피 상호 작용을 연구하는 데 사용되었던 IVM에 대한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 형광 접합 항체로 표지되거나 내인성 형광을 위해 유전적으로 변형된 혈소판의 측두 혈소판-내피 접착을 비교하는 데 사용되었습니다⁴. 이 프로토콜은 간 염증의 내독소 모델에서 간 정현파의 일시적인 혈소판-백혈구-내피 상호 작용을 평가하고 P-셀렉틴과 재조합 단백질을 공동 국소화하는 데 사용되었습니다. 또한 이 프로토콜을 통해 표준 조직학을 사용하여 호중구 밀도에서 보이는 차이가 적혈구 속도의 차이(체적 유량에 대한 대용물)의 결과인지 여부를 확인할 수 있었습니다⁵. 마지막으로, 이 방법은 APAP에 의한 간 손상의 급성 모델에서 간 정현파에서 Kupffer 세포에 의한 혈소판 동원을 평가하는 데 사용되었습니다⁶. 이러한 일련의 연구는 표준 조직학적 방법으로는 불가능했을 것입니다. 앞서 언급한 바와 같이, 이 프로토콜은 다양한 이미징 시스템에 적용할 수 있으며, 적절한 수술 준비, 형광 항체 선택 및 이미징 설정을 통해 이 프로토콜은 간 병리학 연구에 매우 신뢰할 수 있고 재현성이 높습니다.

프로토콜

모든 동물 프로토콜은 Baylor College of Medicine의 Institutional Animal Care and Use Committee와 Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center의 Research & Development Committee의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 말기이며, 안락사는 마지막에 마취의 외과적 평면 아래에서 수행됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 항체 및 염료의 제조

1. 항체 및 염료 선택
   참고: 관찰된 동시 색상의 수는 특정 현미경 설정에 따라 달라집니다. 여기에 사용된 시스템에서는 4개의 서로 다른 파장을 동시에 시각화할 수 있습니다.
   1. 선박 시각화:
      1. 실험 설계에 따라 혈관 구조에 내피 특이적(예: CD31) 항체 및/또는 혈장에 균일하게 분포된 분자(예: 덱스트란 또는 알부민)로 표시합니다.
         참고: 이 문서에서는 Texas Red 표지 덱스트란(150kDa, 250μg/마우스)의 사용에 대해 설명합니다. 이 큰 분자량 단백질의 이점은 급성 염증이 발생하는 동안 혈관 구조 내에 머물 수 있다는 것입니다. 항체 표지를 사용할 때 내피 기능을 방해할 가능성이 있는 항체를 피하기 위해 주의해야 합니다.
   2. 혈소판 시각화:
      1. 혈소판을 식별하려면 유전자 변형 마우스(예: R26R-EYFP^f/f/PF4-Cre) 또는 IVM에 대한 혈소판 특이적(예: 항-GPIbβ) 항체를 사용합니다. 혈소판의 형광 표지 사용에 관한 자세한 내용은 이전 간행물⁴를 참조하십시오.
         참고: 여기서는 DyLight488 표지 항GPIbβ 항체(X488, 6μg/마우스)가 사용됩니다. 항체 라벨링을 사용할 때 혈소판 기능이나 접착에 대한 간섭을 피하기 위해 주의해야 합니다.
   3. 백혈구 시각화:
      1. 혈소판 이미징과 유사하게, 유전자 변형 마우스(예: 과립구의 경우 LysM-EGFP) 또는 백혈구 특이적 항체(예: 쥐 호중구의 경우 Ly6G)를 사용하여 관심 백혈구를 시각화합니다. 이 프로토콜을 따르려면 Brilliant Violet 421(BV421) 표지 anti-Ly6G 항체(3μg/마우스)를 사용하십시오. 급성(<6시간) 실험에서는 동물당 3μg의 항-Ly6G(클론 1A8)로 호중구를 표시합니다.
         참고: 항-Ly6G 항체(클론 1A8)를 사용할 때, 이 항체는 최소 24시간 후 및/또는 반복 주사 후 호중구(0.05-1mg 항체/마우스)^7-9를 고갈시키는 데 사용되었다는 점에 유의해야 합니다. 항-Ly6G(1A8) 항체는 또한 전부는 아니지만 특정 상황에서 높은(낮지는 않은) 전단 응력에서 호중구 접착 및 전이에 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다 ^9,10. 따라서 항체 투여량은 각 사례마다 신중하게 선택해야 합니다.
   4. 추가 단백질:
      1. 특정 이미징 시스템에서 사용할 수 있는 레이저 및 필터 세트/검출기의 수에 따라 더 많은 파장을 추가하여 더 많은 물체를 동시에 식별하면서 스펙트럼 중복을 피하도록 주의하십시오.
         참고: 이 프로토콜은 PerCP-eFluor 710 표지 anti-P-selectin 항체(4μg/마우스)를 사용하여 4번째 물체인 P-selectin(클론 Psel.KO2.3)의 이미징을 설명합니다. 이 논문에 있는 대부분의 설명과 이미지는 LPS로 인한 급성 간 손상에 대한 것이지만 다른 손상 모델도 관심을 가질 수 있으며 대체 레이블이 필요할 수 있습니다. APAP에 의한 손상⁶에 사용되는 항체에 대한 설명은 토론을 참조하십시오.
2. 방부제 제거 및 살균
   참고: 동물에게 주입할 수 있는 상업적으로 이용 가능한 항체와 염료가 있지만, 대부분은 동물에게 해롭거나 혼란스러운 변수를 추가할 수 있는 운반체 또는 방부제(예: 아지드화나트륨)를 가지고 있습니다. 운반체 또는 방부제를 함유한 항체 및 염료는 칼슘 또는 마그네슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS^-/-; 또는 기타 생리학적 완충제)에 대해 투석해야 합니다.
   1. 500mL DPBS^-/- (투석할 항체/염료의 ~1,000배 부피)를 마그네틱 교반 막대가 있는 비커에 붓습니다. 7,000MWCO 카세트를 플로트 부표에 부착하고 투석 버퍼에 최소 5분 동안 넣어 멤브레인을 프리컨디셔닝합니다. 카세트를 제거하고 보푸라기가 없는 티슈로 플라스틱 가장자리를 닦아내십시오. 투석막을 만지지 마십시오.
   2. 18-20G 바늘을 사용하여 4개의 포트 중 하나를 통해 항체/염료를 카세트에 주입합니다. 항체/염료가 든 카세트를 투석 버퍼에 넣습니다. 비커를 자석 교반기에 놓고 4°C에서 최소 1시간 동안 투석합니다. 투석 버퍼를 변경합니다.
   3. 1.2.2단계에서 투석 및 투석 완충액 교체를 최소 2회 이상(최소 3회 교환) 반복합니다.
   4. 카세트를 제거하고 보푸라기가 없는 티슈로 플라스틱 가장자리를 닦아내십시오. 투석막을 만지지 마십시오. 18-20G 바늘을 사용하여 사용하지 않는 포트를 통해 카세트의 항체/염료를 흡인합니다.
   5. 조직 배양 후드에서 동물에 사용하기 전에 0.2μm 필터를 사용하여 제제를 멸균합니다. 사용하지 않은 부분은 4°C의 멸균 튜브에 보관하십시오.
3. 컨트롤
   1. 각 실험에 필요한 정확한 대조군은 연구 설계에 따라 다르지만, 연구 결과를 분석할 때 비특이적 표지 및 생물학적 효과를 제외하기 위해 적절한 가짜 코호트, 차량 처리 및 비차량 처리 그룹, 동형을 포함해야 합니다.

2. 복강내 내독소 주사

참고: 쥐 패혈증의 실험 모델에서 간 정현파의 혈소판-호중구-내피 상호작용을 평가하기 위해 내독소 주사를 사용할 수 있습니다.

1. 주사할 내독소의 양을 결정하기 위해 마우스의 무게를 측정합니다(5mg/kg; 대장균 혈청형 O111:B4; 내독소 함량 1 x 10⁶ EU/mg).
   참고: 내독소 효능 및 효과는 종 및 균주에 따라 다르며 로트마다 다를 수 있습니다¹¹. 따라서 결과의 일관성을 극대화하기 위해서는 동일한 로트의 내독소¹²로 실험을 수행해야 합니다.
2. 생리식염수(0.9% 염화나트륨)로 희석한 내독소를 27G 바늘이 부착된 주사기에 넣습니다. 주로 사용하지 않는 손에서는 엄지와 검지를 사용하여 목덜미를 잡고 마우스를 잡습니다. 다른 손을 사용하여 꼬리를 당겨 복부를 드러내고 꼬리를 다섯 번째 손가락과 주로 사용하지 않는 손의 손바닥 사이에 놓습니다.
3. 70% 에탄올로 복부를 청소하십시오. 왼쪽 아래(또는 오른쪽) 복부에 바늘을 삽입하고 내독소를 주입합니다.
   알림: 실험을 혼란스럽게 할 수 있는 장기 손상(예: 장, 장, 신장 등의 손상)의 위험이 있으므로 바늘을 너무 깊게 삽입하지 않도록 주의해야 합니다.
4. 생리식염수(또는 차량)를 사용하여 대조 동물에서 2.1-2.3단계를 수행합니다.
   참고: APAP에 의한 간 손상은 내독소(endotoxin)가 아닌 APAP를 사용하여 위와 유사한 방법론을 사용하여 수행할 수 있습니다⁶. APAP에 의한 간 손상 모델과 관련된 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.

3. 동물의 마취와 안락사의 유도 그리고 정비

1. 동물을 마취 수술 평면 아래에 놓습니다. 노즈콘 또는 기관절개관을 통해 흡입된 이소플루란을 사용하여 마취를 유지합니다. 발가락이 끼인 후 움직임을 모니터링하여 마취 수준을 평가하고 조정합니다.
2. 모든 실험이 끝나면 마취 수술 평면에서 피를 흘린 후 양측 기흉술을 통해 안락사를 수행합니다.

4. 경정맥과 기관의 카테터 삽입

1. 호흡을 용이하게 하기 위해 기관절개술을 시행하고 라벨링된 항체/염료를 주입하기 위해 혈관 카테터를 배치합니다.
   참고: 외과적 박리 현미경 또는 확대경은 카테터 삽입에 도움이 됩니다.
2. 목과 복부의 털을 면도하십시오. 여분의 머리카락을 제거하십시오. 동물을 보온 패드에 올려 체온을 37°C로 유지하고 직장 프로브를 사용하여 심부 온도를 모니터링합니다. 베타딘으로 목을 문지른 다음 에탄올 70%를 바르십시오.
3. 목을 세로로 정중선을 절개하고 둔기 절개를 사용하여 기관을 노출시킵니다.
   1. 기관절개술
      1. 21G의 뭉툭한 바늘이 삽입된 기관절개술 튜브 PE90 튜브를 준비합니다(그림 1A).
         참고: 기관절개관 끝에 ~45° 경사를 추가하면 기관절개관을 기관에 쉽게 삽입할 수 있습니다. 또는 18-20G 말초 정맥 주사 카테터로 PE90 튜브를 대체할 수도 있습니다.
      2. 피부와 근막을 절개하면 타액선을 중앙에서 멀리 반사시킵니다.
      3. 둔기 절개를 사용하여 흉골 근육을 분리하여 기관에 더 잘 접근할 수 있도록 합니다.
         참고: 기관에 인접한 공급 혈관과 경동맥을 피하도록 주의하십시오.
      4. 기관의 복부/앞쪽에 있는 기관 고리 사이에 작은(~1-2mm) 수평 절개를 만듭니다(그림 1B).
         알림: Vannas 가위를 사용하면 적절한 해부가 용이합니다. 기관의 앞쪽 면 만 절개해야 합니다. 기관을 완전히 절개하면 기관을 캐뉼링하기 어렵게 만들고 주변 혈관 구조를 손상시킬 위험이 있습니다.
      5. 기관절개관을 구멍에 통과시킵니다. 튜브의 끝이 카리나를 지나 삽입되지 않도록 합니다.
      6. 기관 링을 지지대로 사용하여 기관과 튜브 주위에 #4-0 실크 봉합사를 묶어 기관 내 기관절개관을 고정합니다(그림 1C).
   2. 외부 경정맥 캐뉼레이션
      1. PE10 튜브(OD 0.61mm, ID 0.28mm)를 한쪽 끝(그림 2 삽입)에 삽입하고 다른 쪽 끝에 22G 또는 23G 뭉툭한 바늘을 삽입한 PE50 튜브(OD 0.97mm, ID 0.58mm)를 사용하여 경정맥 카테터(그림 2)를 준비합니다. 접착제를 사용하여 튜브가 미끄러지거나 누출되지 않도록 하십시오. 멸균 생리식염수로 채워진 주사기를 부착하여 카테터를 세척합니다.
      2. 타액선 반사 후 외부 경정맥(EJV)을 노출시킵니다. 둔기 박리를 사용하여 주변 결합 조직에서 EJV를 제거합니다(그림 3A).
      3. #4-0 실크 봉합사를 사용하여 시각화된 EJV의 두개골 끝을 접합하고 EJV의 꼬리 끝 주위에 느슨한 고리를 놓습니다(그림 3B). 각 봉합사의 끝을 지혈기로 고정하고 두 지혈제를 서로 부드럽게 집어넣어 EJV를 노출시키는 데 도움이 됩니다.
         참고: 캐뉼레이션을 위한 최적의 영역은 두개골 전방 경정맥의 가지와 꼬리 방향의 내부 경정맥 사이입니다. 봉합사 배치를 용이하게 하려면 봉합사 조각(~15cm)을 반으로 접고 한 쌍의 집게로 EJV 아래의 구부러진 끝을 통과시키면서 별도의 집게로 EJV를 들어 올려 혈관이 굴러가는 것을 방지합니다. 그런 다음 봉합사를 잘라 두 개의 별도 길이를 만듭니다.
      4. Vannas 가위를 사용하여 EJV의 전방 표면을 작게(~1mm) 절개합니다. 절개 부위를 통해 구부러진 30G의 뭉툭한 바늘(뭉툭하게 줄지로 줄지어 바늘 끝에 삽입된 0.15mm 미세 핀으로 보강됨)을 EJV에 삽입하고 부드럽게 들어 올려 일반 식염수가 포함된 카테터가 EJV로 쉽게 통과할 수 있도록 합니다.
         알림: 카테터와 허브에 삽입하고 마우스에 세척하기 전에 기포가 없는지 확인하십시오. 공기 색전은 동물에게 치명적일 수 있습니다.
      5. 카테터가 EJV 내에 있으면 카테터가 정맥 깊숙이 통과할 수 있을 만큼만 꼬리 고리를 풉니다. 혈액을 흡인하고 카테터를 세척하여 누출 여부를 확인하여 카테터의 위치를 확인합니다(그림 3C).
      6. 꼬리 고리를 사용하여 EJV 내에 카테터를 고정합니다. 두개골 봉합사를 사용하여 카테터를 EJV의 두개골 끝에 고정하여 우발적인 탈환을 최소화합니다(그림 3D).
      7. 목 절개 부위를 # 4-0 실크 봉합사로 닫습니다.

5. 간의 외부화

1. 베타딘 스크럽으로 복부를 청소한 다음 에탄올 70%를 바르십시오.
2. 흉골 기저부에서 시작하여 상복부 피부를 ~1cm 수직 절개합니다. 둔기 절개를 사용하여 복부 근육에서 피부를 분리하십시오. 다음 단계에서 출혈을 최소화하기 위해 피부와 근육의 큰 영양 혈관을 소작합니다(그림 4A).
3. 피부를 ~1-2cm 수평으로 절개한 다음 복부 근육을 절개하고 5.2단계에서 수직 절개를 눈에 보이는 간 상단에서 대략 이등분합니다. 피부의 지혈을 돕기 위해 소작 도구를 사용하십시오(그림 4B).
   참고: 복부 절개 부위의 크기는 최적의 간 영상 촬영에 매우 중요합니다. 개구부가 너무 작으면 간 동맥 및/또는 문맥의 과도한 스트레칭 또는 충돌로 인한 간 허혈의 위험이 있습니다. 개구부가 너무 크면 장과 같은 다른 장기도 외부로 돌출되어 이미징을 방해할 수 있습니다.
4. 2 in x 2 in 거즈 중앙에 약 1cm 원을 만들고 따뜻한 생리식염수를 적십니다. 구멍이 절개 부위의 중앙에 오도록 거즈를 배치합니다. 절개 부위의 가장자리를 부드럽게 당겨 벌리고 복부에 가벼운 위쪽 압력을 가하여 간이 축축한 거즈 위에 쉽게 놓이도록 간을 외부화합니다(그림 4C).
5. 마우스를 엎드린 자세로 이미징 트레이에 놓고 간이 커버슬립 중앙에 오도록 합니다(그림 4D).
   참고: 대조 동물에서는 간이 적갈색으로 보여야 합니다. 양방향 공명 헤드 스캐너가 있는 도립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경이 이 프로토콜의 IVM에 사용됩니다. 따라서 3D 프린터를 사용하여 맞춤형 IVM 트레이를 만들었습니다(그림 5). 3D 프린팅을 위해 생성된 .stl 파일이 제공됩니다(보충 파일 1). 개인의 필요에 맞게 조정이 필요할 수 있습니다.
6. 동물을 도립 현미경으로 옮깁니다.

6. 간 생체 내 현미경 검사법 화상 진찰

참고: 이 프로토콜은 생체 내 현미경 검사를 위해 양방향 공명 헤드 스캐너가 있는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용합니다. 공진두 주파수를 안정화하려면 이미징하기 최소 30분 전에 시스템을 켜십시오. 시스템마다 기능이 다를 수 있습니다. 이에 대한 설명은 이 문서의 범위를 벗어납니다. 특정 시스템의 기술적 세부 사항에 대해서는 장비 담당자에게 문의하십시오.

1. 마취 상태를 유지하려면 동물을 이소플루란 전달 시스템에 연결합니다.
   참고: 실험 프로토콜에 따라 기계적 환기가 필요할 수 있습니다(자연 환기와 비교).
2. 직장 프로브를 사용하여 동물 위에 복사 보온 패드를 놓고 심부 온도를 37°C로 유지합니다.
   알림: 이 프로토콜에서 IVM 트레이 주위에 맞는 직사각형 폼 조각은 복사 보온 패드를 놓을 절연체 및 스페이서 역할을 합니다(그림 4D).
3. 대물렌즈 포탑을 원하는 배율로 설정하고 필요에 따라 이멀젼 오일을 도포합니다. 이 프로토콜을 따르려면 1x 광학 줌과 함께 60x/NA1.30 실리콘 오일 대물렌즈를 사용하십시오.
4. 초점면이 확인되면 간 가장자리 근처의 영역을 피하면서 ≥10개의 무작위 시야를 식별합니다.
   참고: 간은 FITC(fluorescein isothiocyanate) 채널에서 자가형광을 나타내므로 epifluorescence를 사용하여 일반적인 초점면을 빠르게 식별합니다.
   1. 시스템에 따라 FITC 채널에서 epifluorescence를 사용하여 보이는 간의 가장자리를 식별하고 (x,y) 단계 좌표를 기록합니다.
   2. 간의 (x,y) 경계와 난수 생성기를 사용하여 임의의 (x,y) 좌표를 식별합니다. 허용 가능한 시야를 보려면 (a) 시야 전체에 분산된 혈관의 존재를 찾으십시오. (b) 동일한 초점면에 있는 혈관의 ≥80%; 및 (c) ≥1 간 가장자리에서 멀리 떨어진 시야( 그림 6의 예). 이미지 분석의 초점이 간 정현파의 혈소판-백혈구-내피 상호작용에 있는 경우, 직경이 ≥15μm인 혈관이 있는 필드를 제외합니다(쥐 정현파는 일반적으로 직경이 ≤10μm임).

7. 이미지 분석

참고: ImageJ/FIJI는 이 문서의 모든 이미지를 처리하는 데 사용되었습니다. FIJI(fiji.sc)는 추가 플러그인 및 매크로¹³을 사용하여 더 많은 기능을 가진 Image J(imagej.nih.gov)의 오픈 소스 버전입니다.

1. ImageJ/FIJI에서 다중 채널 타임랩스 파일을 엽니다.
   참고: 플랫폼에 따라 추가 프로그램/플러그인이 필요할 수 있습니다. ImageJ/FIJI에는 Olympus의 .oir 파일과 같은 다양한 유형의 파일을 열 수 있는 Bio-Formats Importer가 있습니다. 여기에서 파일은 더 널리 사용되는 형식이기 때문에 .tif로 변환되었습니다.
2. 올바른 스케일이 설정되어 있는지 확인하십시오. 메타데이터/속성에서 픽셀/μm 비율과 시간 간격을 찾습니다.
3. 다른 필터를 사용하여 배경 노이즈를 제거합니다(예: 이 프로토콜에서 사용되는 2픽셀 반경의 중앙값 필터). 후처리의 변동을 최소화하기 위해 모든 이미지 간에 처리가 유사한지 확인합니다. 이러한 실험에서 개수와 길이를 비교할 때 평균 형광 강도 대신 필터링하여 명확성과 세포-세포 상호 작용의 식별 및 측정을 개선합니다.
   참고: 필터의 사용 및 크기는 관심 대상의 크기와 이미지의 신호 대 잡음 비율에 따라 달라집니다.
4. 혈관 밀도에서 시야 간에 이질성이 있으므로 선택 브러시를 사용하여 각 시야의 총 혈관 면적을 측정합니다(그림 7).
   1. 타원형 선택 도구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택 브러시 도구를 선택합니다.
   2. 선택 브러시 도구 아이콘을 두 번 클릭하여 브러시의 크기를 조정합니다.
   3. 선박을 추적하여 강조 표시/선택합니다. 선택 영역의 일부를 삭제하려면 [alt]-왼쪽 클릭 을 사용하고 [shift]-왼쪽 클릭을 사용하여 파트를 추가합니다.
   4. [M]을 눌러 선택한 영역을 측정합니다.
      참고: 이미지 스케일이 올바르게 설정된 경우 출력은 μm² 단위여야 하며 mm²로 변환됩니다.
5. 현장에 있는 혈소판과 백혈구의 수를 세십시오. 세포가 30초 이상 <1 세포체를 이동한 경우 세포가 부착된 세포로 간주합니다. mm당 세포(혈소판 및/또는 백혈구) 수를 계산합니다².
6. 각 혈관 내의 상대적 혈류를 추정하려면 앞에서 설명한 대로 ImageJ/FIJI(imagescience.org/meijering/ software/mtrackj⁾¹⁴의 MTrackJ 플러그인을 사용하여 대리모로 평균 적혈구(RBC) 속도를 측정합니다⁵. 적혈구를 dextran 채널에서 원형 또는 디스크 모양의 충전 결함으로 식별합니다. 기록 보관, 비동기 분석 및 검증을 위해 트랙을 저장합니다.
   참고: 이에 대한 예는 그림 8 및 추가 비디오 S1에 나와 있습니다.

결과

염증이 생긴 내피에 대한 백혈구 유착에서 비멘틴 막대 도메인의 효과 평가
백혈구 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)이 내피 및 혈소판 P-셀렉틴에 결합하는 것은 패혈증으로 인한 간 손상 염증의 급성기에 발생합니다. 그러나 비멘틴(rhRod)의 재조합 인간 막대 도메인은 P-셀렉틴에 결합하고 내피와 혈소판 모두에 대한 백혈구 부착을 차단하는 것으로 나타?...

토론

이 방법 논문의 목적은 항상성 조건 하에서 그리고 내독소 또는 APAP 투여 후 마우스 간의 고해상도 생체 내 이미지 및 비디오를 안정적으로 캡처하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명하는 것입니다. 이 프로토콜을 통해 간의 혈소판-백혈구-내피 상호 작용에 대한 데이터를 일관되게 생성할 수 있었지만, 이 이미징 패러다임을 사용할 때 피해야 할 중요한 잠재적 위험뿐만 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Supplies
2" x 2" non-woven sponges	McKesson Med. Surg	92242000	For liver isolation
#4-0 silk braided suture with needle	SOFSILK	N/A	4-0 Softsilk coated braided black, nonabsorbable: C-1 cutting needle
#4-0 silk braided suture without needle	Ethicon	N/A	4-0 Black braided silk, nonabsorbable
21 G blunt needle (0.5 inch)	SAI Infusion Technologies	B21-50	This is used to attach to the end of the tracheostomy tube to allow for connection to the ventilator. An alternative source is Instech
23 G blunt needle (0.5 inch)	SAI Infusion Technologies	B23-50	This is used for the vascular catheter to allow for connection to a syringe. An alternative source is Instech
Dissecting Scissors (Pointed Tip)	Kent Scientific	INS600393-G	Micro Dissecting Scissors; Carbide Blades; Straight; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4 1/2" Overall Length
McPherson-Vannas Micro Scissors (Vannas)	Kent Scientific	INS600124	These are useful for creating the openings in the trachea and vessels
Polyethylene tubing 10	Instech	BTPE-10	This is used to make the intravascular portion of the catheter. An alternative source is BD Intramedic
Polyethylene tubing 50	Instech	BTPE-50	This is used to make the extravascular portion of the catheter.  An alternative source is BD Intramedic
Polyethylene tubing 90	Instech	BTPE-90	This is used to make the tracheostomy tube.  An alternative source is BD Intramedic
USP grade sterile normal saline	Coviden	8881570121	Hospira 0.0% Sodium Chloride Injection, USP
Microscopy Supplies
Isoflurane delivery system and ventilator	Kent Scientific	Somnosuite	Combination rodent ventilator and volatile anesthetic delivery system
Foam spacer for warming pad during microscopy	N/A	N/A	This spacer should be cut from high quality foam, should fit around the liver microscope tray and specific height dimensions are dependent upon the microscope system
Laser scanning confocal microscope system with resonance head scanner	Olympus	FV3000	Although we describe the use of an Olympus FV3000 using a resonance head scanner, this protocol with work with most imaging systems
Liver Microscope Tray	N/A	N/A	The liver microscope tray was designed for an inverted microscope
Antibodies & Related Reagents
Brilliant Violet 421/anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127628	3 µg/mouse. To label neutrophils
BV421/F4/80 antibody	BioLegend	123132	0.75 mg/kg. To label Kupffer cells
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium or magnesium	Gibco/ThermoFisher Scientific	14190144	Used as dialysate to remove sodium azide from antibodies
DyLight649/anti-GPIbβ antibody	emfret Analytics	X649	3 µg/mouse. To label platelets
DyLight488/anti-mouse GPIbβ antibody	emfret Analytics	X488	6 µg/mouse. To label platelets
Endotoxin from Escherichia coli serotype O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024	5 mg/kg; Potency of endotoxin may vary from lot to lot. Therefore, the same lot should be used for a series of experiments to minimize variation due to endotoxin lot
PerCP-eFluor 710/anti-mouse P-selectin antibody	Invitrogen	46-0626-82	4 µg/mouse. To label P-selectin
Slide-a-Lyzer 7,000 MWCO cassette	Thermo Scientific	66370	Used to dialyze antibodies to remove sodium azide
Texas Red-labeled dextran	Sigma-Aldrich	T1287	~150 kDa; 250 µg/mouse
TRITC/bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2289	500 µg/mouse. Dilute to a stock concentration of 50 mg/mL (5%) in normal saline. Used to label the vasculature. It may leak into the interstitial space more readily than high molecular weight dextran during inflammation