Адоптивный перенос IL-33-стимулированных макрофагов в блеомицин-индуцированные мышиные модели для изучения их влияния на идиопатический легочный фиброз in vivo

Резюме

Этот протокол описывает выделение легочных интерстициальных макрофагов (ИМ) и их адоптивный перенос после стимуляции IL-33 альвеол легких на мышиной модели, что может облегчить исследование идиопатического легочного фиброза (IPF) in vivo .

Аннотация

Воспалительная реакция, вызванная ранним повреждением легких, является одной из важных причин развития идиопатического легочного фиброза (ИЛФ), который сопровождается активацией воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, а также высвобождением воспалительных факторов, включая TNF-α, IL-1β и IL-6. Известно, что раннее воспаление, вызванное активированными легочными интерстициальными макрофагами (ИМ) в ответ на стимуляцию IL-33, играет жизненно важную роль в патологическом процессе IPF. Этот протокол описывает адоптивный перенос IM, стимулированных IL-33, в легкие мышей для изучения развития IPF. Он включает в себя выделение и культивирование первичных IM из легких мыши-хозяина с последующим приемным переносом стимулированных IM в альвеолы мышей-реципиентов IPF, индуцированных блеомицином (BLM) (которые ранее были истощены альвеолярными макрофагами путем лечения клодронатными липосомами) и патологическую оценку этих мышей. Репрезентативные результаты показывают, что адоптивный перенос макрофагов, стимулированных IL-33, усугубляет легочный фиброз у мышей, что позволяет предположить, что проведение эксперимента по адоптивному переносу макрофагов является хорошим техническим средством для изучения патологии IPF.

Введение

Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) - это диффузное воспалительное заболевание легких, вызванное многими факторами¹. В цитокиновом микроокружении иммунного ответа Th1 и Th2 макрофаги могут быть поляризованы на классически активированные макрофаги (M1) и альтернативно активированные макрофаги (M2). Липополисахариды (ЛПС) или цитокин ИФН-γ индуцируют макрофаги М1 поляризоваться и продуцировать провоспалительные цитокины, включая iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α и IL-12. Напротив, цитокины II типа IL-4 и IL-13 управляют поляризацией макрофагов M2, которые могут продуцировать различные факторы, стимулирующие рост фибробластов, такие как TGF-β и PDGF, которые способствуют легочному фиброзу². Патологический процесс ИЛФ сопровождается активацией и инфильтрацией макрофагов. IPF опосредует восстановление травмы, воспаление и фиброз за счет высвобождения цитокинов³. Поскольку доступны лишь ограниченные терапевтические возможности, изучение молекулярных патологических механизмов ИЛФ имеет большое значение для разработки новых стратегий профилактики и лечения ИЛФ. Предыдущие исследования, проведенные нашей группой и другими исследователями ^4,5, подтвердили повышенное высвобождение IL-33 у пациентов с IPF и на мышиных моделях с блеомицином (BLM)-индуцированным IPF. IL-33 высвобождается эпителиальными и эндотелиальными клетками во время фиброза и участвует в активации макрофагов, что приводит к аномальной пролиферации фибробластов, инфильтрации лейкоцитов и, в конечном итоге, к потере функции легких⁵. Текущий протокол описывает адоптивный перенос IL-33-стимулированных интерстициальных макрофагов (IM) в альвеолы в качестве средства изучения развития IPF на мышиных моделях. Здесь IM выделяли из легочной ткани мышей-хозяев, культивировали in vitro, стимулировали IL-33 в течение 24 ч, а затем адоптивно переносили в альвеолы мышей-реципиентов путем инъекции в трахею. Было обнаружено, что прямой сбор стимулированных макрофагов мыши и их адаптационный перенос в альвеолы реципиента усугубляет степень легочного фиброза и может более наглядно проиллюстрировать влияние стимулирующих факторов на фиброз по сравнению с предыдущими исследованиями⁶. Метод, описанный в этой статье, может позволить исследователям изучить функцию макрофагов, стимулируемых потенциальными цитокинами, в развитии IPF.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментального благополучия животных Университета Цзяннань (JN No 20211,¹³⁰m1720615[501]).

ПРИМЕЧАНИЕ: Всего в этом исследовании было использовано 10 мышей-самцов C57BL/6 в возрасте 6-8 недель и весом 20-25 г. Три экспериментальные группы в исследовании включали по три мыши-реципиента каждая, и одна мышь-хозяин использовалась для выделения IM.

1. Истощение легочных макрофагов мыши

1. Достаньте флакон с клодронатными липосомами (см. Таблицу материалов) из холодильника за 30 мин, подогрейте его до комнатной температуры и несколько раз перевернуте, чтобы обеспечить равномерное перемешивание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клодронатные липосомы инкапсулируют гидрофильные молекулы дихлорметиленбисфосфоната. Когда эти липосомы потребляются макрофагами, клодронат постепенно высвобождается под действием лизосомной фосфатазы, и, следовательно, его накопление вызывает апоптоз клеток и истощение макрофагов⁷.
2. Обезболивают мышей 3% изофлураном. Проверьте глубину анестезии, ущипнув одну ногу, чтобы проверить сознание. Нанесите ветеринарную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
3. Аспирируют 60 мкл клодронатных липосом с помощью пипетки со стерильным всасывающим наконечником. Вводят лекарство по каплям в носовую полость анестезированной мыши, так что при вдыхании мыши лекарство вдыхается в трахею. После каждой капли убедитесь, что мышь полностью вдыхает препарат и дышит ровно. Вводят липосомы, содержащие только PBS, в качестве контроля⁸ (рис. 2).
4. Поместите мышей на стол с постоянной температурой 38 ° C для повторного нагрева, чтобы ускорить их выздоровление. Следите за мышами, пока они не проснутся. После того, как мыши хорошо восстановятся и достигнут лежачего положения грудины, переведите их в клетку.
5. Используйте мышей с истощенными альвеолярными макрофагами через 2 дня после лечения клодронатными липосомами в качестве мышей-реципиентов для эксперимента по переносу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании истощение альвеолярных макрофагов было подтверждено проверкой экспрессии маркеров макрофагов, как описано ранее ^8,9, после ингаляционного введения клодронатных липосом (см. Дополнительный рисунок 1).

2. Изоляция и культура ИМ

1. Обезболивайте мышь-хозяина внутрибрюшинной инъекцией кетамина (120 мг/кг) и ксилазина (16 мг/кг). Подтвердите глубину анестезии с помощью потери рефлекса защемления пальцев ног. Нанесите ветеринарную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Затем продезинфицируйте кожу анестезированной мыши 75% спиртом и йодом. Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу и обнажить сердечно-легочную ткань
2. Аспирируйте 10 мл 1x PBS в шприц с иглой 20 G и вставьте кончик иглы в правое предсердие мыши (рис. 3A). Разрежьте нижнюю полую вену мыши хирургическими ножницами, а затем вручную перфузируйте мышь PBS с постоянной скоростью (10-20 мл / мин), пока легочная ткань не побелеет. Иссеките легочную ткань и перенесите ее в ледяной PBS в чашке для культивирования (рис. 3B).
3. Разрежьте легочную ткань на фрагменты размером примерно 2 мм х 2 мм х 2 мм. Затем добавьте 15 мл модифицированной среды Дульбекко Игла (DMEM), содержащей 1% коллагеназы А, в легочную ткань, чтобы изолировать макрофаги. Инкубировать при 100 об/мин в течение 30 мин на встряхивающем столе при температуре 37 °C.
4. Аспирируйте суспензию легочной ткани через шприц объемом 10 мл не менее 20 раз, чтобы сделать ее как можно более тонкой. Отфильтруйте эту суспензию через сетчатое фильтр для клеток размером 40 мкм. Центрифугируйте фильтрат при 400 x g в течение 10 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
5. Лизируют эритроциты в гранулах, добавляя 3 мл буфера для лизиса эритроцитов (см. Таблицу материалов) на льду в течение 2-3 мин.
6. После центрифугирования в дозе 150 x g в течение 5 мин ресуспендируют клеточную гранулу 10 мл DMEM (содержащего 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
7. Засейте клетки в 10-сантиметровые чашки для клеточных культур в количестве 2 x 10⁷ клеток на чашку и инкубируйте в течение 1 часа при 37 ° C и 5% CO₂. Это позволяет легким IM прилипать к тарелке⁵. Через 1 ч аспирируют надосадочную и плавающую клетки и добавляют 10 мл свежей полной питательной среды (ДМЭМ, содержащей 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Инкубация более 8 ч или ночь.
8. Определите чистоту полученных ИМ с помощью проточной цитометрии с окрашиванием на маркеры F4/80 и CD11c, как описано ранее⁵ (см. дополнительный рисунок 1).

3. Адоптивный перенос ИМ в альвеолы легких

1. Замените питательную среду из пластины, содержащей изолированные легочные ИМ (этап 2.7), на полную питательную среду, содержащую 10 нг/мл IL-33 для стимуляции ИМ. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO₂. Используйте 1x PBS вместо Ил-33 в качестве контроля.
2. Диссоциируйте легочные IM, обрабатывая их 1 мл 0,25% трипсина в течение 5 минут. Затем утолите пищеварение, добавив 3 мл свежей культуры, и соберите легочные макрофаги, центрифугируя клеточную суспензию при 150 x g и 4 ° C в течение 5 минут. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и ресуспендируйте клетки в PBS до конечной концентрации 5 x 10⁵ клеток / 50 мкл.
3. Анестезируйте мышей-реципиентов 3% газом изофлураном. Дождитесь, пока мышь потеряет сознание (как в шаге 1.2), а затем зафиксируйте конечности анестезированной мыши на вертикальной пластине с помощью медицинской ленты. Аккуратно потяните язык мыши в сторону с помощью ватного тампона.
4. Включите лампу интубации и посветите ею на горло мыши так, чтобы была видна трахея. Убедитесь, что трахея находится близко к основанию языка, пищевод находится возле задней части шеи, но отверстие пищевода не видно во время операции.
5. Используйте лампу для интубации мыши (22 G). Направьте внутреннюю игольчатую канюлю в трахею с помощью направляющей проволоки (диаметр 0,4 мм). Снимите направляющий провод и вставьте канюлю в трахею мыши, чтобы завершить интубацию.
6. После того, как канюля войдет в трахею, введите 50 мкл клеточной суспензии (содержащей 5 x 10⁵ IM) мыше-реципиенту через трахею.
7. Поместите мышей на постоянную грелку при температуре 38 ° C для повторного разогрева, чтобы ускорить восстановление. Следите за мышами, пока они не проснутся. После того, как они хорошо восстановятся и достигнут лежачего положения на грудине, переведите их в клетку.
8. Через 24 часа вводят блеомицин (BLM) через трахею (используя процедуру, описанную на этапах 3.3-3.5) в дозе 1,4 ЕД/кг массы тела, чтобы вызвать ИЛФ. Введите равный объем физиологического раствора контрольной группе.
9. Через 21 день определите степень тяжести легочного фиброза для различных групп мышей, которые были адоптивно перенесены с PBS или суспензией IM, стимулированной IL-33, путем оценки экспрессии маркеров фиброза и баллов Эшкрофта¹⁰.
   1. Извлеките общую РНК из легочной ткани с помощью реагента для экстракции РНК (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количественный анализ проводился с помощью считывателя микропланшетов. Если соотношение OD260/OD280 составляет 1,8-2,0, чистота РНК высокая. Все образцы хранились при температуре −80 °С.
   2. Проведите флуоресцентную количественную ПЦР для оценки экспрессии α-гладкомышечного актина (СМА) и фибронектина с использованием специальных праймеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры, используемые для α-SMA, были прямым 5'-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACG-3' и обратным 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', а праймеры, используемые для фибронектина, были прямым 5'-TCTGGGAAATGGAAAGGGGAATGG-3' и обратным 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.
10. Выполните иммуногистохимию, как описано ниже.
    1. Обезвоживайте левое легкое, встраивайте его и нарезайте парафиновым слайсером до толщины 4 мкм.
    2. Поместите срезы ткани на предметные стекла и запекайте их в духовке при температуре 65-70 ° C в течение от 30 мин до 1 ч. Удаляйте воски с предметных стекол с уменьшающимся процентом спирта (т.е. 100%, 95%, 90%, 80% и 70% спирта) в течение 5 минут.
    3. Окрашивают предметные стекла в растворе гематоксилинового красителя (аналитически чистом) в течение 5 мин. Затем промойте предметные стекла водопроводной водой. Замочите предметные стекла в 1% спирте соляной кислоты на 3 с, смойте плавающий цвет и замочите в проточной воде на 5 мин. Секции станут синими.
    4. Погрузить в раствор эозина на 10 с - 1 мин (время окрашивания определяют по цвету), промыть водопроводной водой и поместить в 70%, 80%, 95%, 100% и 100% спирт соответственно на 5 мин каждый. Затем поместите предметные стекла в растворы ксилола I и ксилола II на 3 мин. После высыхания наблюдайте и делайте фотографии под вертикальным микроскопом с нейтральной клейкой герметизирующей пленкой.
    5. Выполните оценку Эшкрофта на срезах, чтобы указать тяжесть легочного фиброза¹⁰. Проведите статистический анализ данных с использованием t-критерия двух независимых выборок.

Результаты

Используемый здесь протокол кратко изложен на блок-схеме на рисунке 1. Вдыхание клодронатных липосом через нос (рис. 2) использовалось для истощения легочных макрофагов взрослых мышей C57BL / 6, и это дало хорошую модель мыши-реципиента. Легочные IM были выдел?...

Обсуждение

Это исследование предоставляет эффективный метод истощения, изоляции, культивирования и переноса макрофагов, который может помочь в изучении механизмов легочного фиброза у мышей. Существует множество методов истощения макрофагов мыши, таких как введение в трахею, инъекция в хвостову...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172