Создание экспериментальной мышиной модели эндометриомы для изучения связанного с ней бесплодия

Резюме

В этом исследовании представлена новая мышиная модель, специально разработанная для моделирования эндометриомы, клинически значимого подтипа эндометриоза. Используя мышей C57BL/6J, модель направлена на выяснение патофизиологических механизмов, лежащих в основе бесплодия, связанного с эндометриомой, предлагая усовершенствованный инструмент для преодоления существующего пробела в знаниях в репродуктивной медицине.

Аннотация

Эндометриома (ОМА), подтип эндометриоза, характеризующийся образованием эндометриоидных кист в яичниках, поражает 17-44% лиц с диагнозом эндометриоз. Женщины с ОМА часто испытывают нарушение фертильности, но точные механизмы, лежащие в основе бесплодия, связанного с ОМА, остаются неясными. Примечательно, что существующие животные модели имитируют поверхностный перитонеальный эндометриоз (SUP) и глубокий инфильтрирующий эндометриоз (DIE), оставляя заметный пробел в исследованиях, посвященных OMA. В ответ на пробел в знаниях в этой статье представлена новаторская модель мыши, имитирующая OMA, и дается всестороннее описание методов и процедур, используемых в модели. С высоким уровнем успеха в 83% и специфичностью поражения яичников, эта модель имеет значительные перспективы для улучшения нашего понимания ОМА, особенно в контексте бесплодия. Он предлагает ценную платформу для проведения целенаправленных исследований проблем, связанных с фертильностью, связанной с ОМА, потенциально прокладывая путь к улучшению диагностических и терапевтических стратегий в области репродуктивной медицины.

Введение

Эндометриома (ОМА) является наиболее преобладающим подтипом эндометриоза, наблюдается примерно у 17-44% лиц с диагнозом эндометриоз ^1,2. Для него характерно образование эндометриоидных кист внутри яичников. Эти цисты, в просторечии называемые «шоколадными цистами», получили свое название из-за их характерной коричневой, похожей на смолу консистенции³. Помимо ОМА, эндометриоз также может проявляться в виде поверхностного перитонеального эндометриоза (SUP) и глубокого инфильтрирующего эндометриоза (DIE). SUP относится к поражениям на перитонеальной слизи, тогда как DIE относится к поражениям, проникающим более чем на 5 мм ниже поверхности брюшины⁴. Гетерогенность по локализации, внешнему виду и глубине поражения среди этих подтипов эндометриоза приводит к различным клиническим симптомам и различной тяжести заболевания ^5,6. ОМА особенно связана с более тяжелыми стадиями эндометриоза и связана с бесплодием, тазовыми спайками и повышенным риском рака яичников 1,7,8,9.

Связь эндометриоза, особенно ОМА, с бесплодием является клинической проблемой, вызывающей серьезную озабоченность. Эндометриоз присутствует у 25-50% бесплодных женщин, при этом у 30-50% женщин с диагнозом эндометриоз наблюдается бесплодие 10,11,12,13,14. В то время как точные механизмы бесплодия, ассоциированного с ОМА, остаются неясными, были выдвинуты некоторые гипотезы. Одно из них предполагает, что эндометриоз приводит к хроническому воспалительному состоянию, которое может нарушить нормальную функцию яичников и ухудшить качество ооцитов^15,16. Другой предполагает аномальную перегрузку железом в фолликулярной жидкости яичников, которая, как полагают, связана с нарушением созревания ооцитов^. Другие исследования посвящены нарушениям гормональной регуляции¹⁷, качеству ооцитов¹⁸ и развитию эмбриона¹⁹.

Исторически сложилось так, что модели грызунов сыграли решающую роль в углублении нашего понимания эндометриоза, особенно в изучении его патологии, влияния на фертильность и механизмов боли 20,21,22,23. Грызуны, особенно крысы и мыши, широко использовались в качестве животных моделей для изучения причинно-следственных связей, основных механизмов, потенциальных методов диагностики и терапевтических вмешательств для этого заболевания 22,24,25,26. Важно понимать, что все животные модели имеют свои конкретные применения и ограничения. Выбор той или иной модели зависит от конкретного результата или аспекта, который измеряется^{или изучается}. Например, модель на крысах показала, что стресс может усугублять проявления эндометриоза и влиять на параметры воспаления, что дает представление о потенциальных^{триггерах заболевания}.

В контексте исследований эндометриоза используются различные модели грызунов. Одним из часто используемых подходов является гомологичная модель, которая включает трансплантацию ткани матки грызуна в брюшную полость или брыжеечные сосуды того же вида²⁹. Эта модель обладает преимуществами с точки зрения иммунокомпетентности и пригодности для долгосрочных исследований³⁰. Тем не менее, ограничения возникают из-за частичного несоответствия между имплантированной эктопической тканью матки мыши и характеристиками эндометриоидных поражений человека³¹. Другим подходом является гетерологичная модель, при которой биопсия эндометрия человека имплантируется мыши с ослабленным иммунитетом³². Данная модель позволяет использовать эктопический эндометрий человека в качестве донорской ткани для развития поражения, обеспечивая конструктивную валидность³². Тем не менее, он полагается на мышей с ослабленным иммунитетом в качестве реципиентов, что препятствует всесторонней оценке иммунных реакций, участвующих в этиологии расстройства^. Тем не менее, важно признать, что существующие модели в первую очередь сосредоточены на отражении обобщенного состояния SUP, неадекватно отражая уникальные характеристики OMA и DIE³⁴. В настоящее время существует небольшое количество конкретных моделей для изучения DIE, существует лишь несколько моделей, включая недавнюю модель грызунов, разработанную Yan et ^al.35. Этот дефицит подчеркивает необходимость дальнейших исследований и разработки моделей, которые точно отражают конкретные характеристики DIE. Кроме того, наше понимание ОМА, особенно ее тонкой связи с фертильностью, также остается ограниченным^26,36.

Решая существующие проблемы, в данной статье представлена новая экспериментальная гомологичная модель мыши, специально предназначенная для моделирования ОМА. Он направлен на то, чтобы дать уникальное представление о патологических механизмах, лежащих в основе бесплодия, связанного с ОМА, тем самым восполнив пробел в знаниях в этой важнейшей области репродуктивной медицины. Короче говоря, мыши C57BL/6J использовались из-за их репродуктивных признаков, схожих с человеческими. После синхронизации цикла течки ткани матки мышей-доноров были измельчены и трансплантированы в овариальную сумку мышей-реципиентов в соотношении 1:2. После 4-недельного интервала были проведены морфологическое и гистологические исследования поражений яичников для подтверждения наличия ОМА и оценки любой связанной с ней фолликулярной атрезии. С 83% успешным показателем, эта модель предлагает исследователям надежную платформу для исследований ОМА, подчеркивая развитие поражений конкретно в яичниках для целенаправленных исследований.

протокол

Все экспериментальные процедуры, проведенные в этом исследовании, были одобрены и регламентированы в соответствии с протоколом No 21-203-MIS_[C] Этическим комитетом Китайского университета Гонконга.

1. Акклиматизация и отбор животных

1. Подготовка мышей
   1. Приобретите 18 мышей C57BL/6J (первородящие самки, 8-9 недель: 6 доноров, 12 реципиентов) у надежного поставщика. Проверьте сертификаты о состоянии здоровья.
   2. Содержание всех мышей в контролируемых условиях содержания: 22-24 °C, уровень влажности от 40% до 60% и 12-часовой цикл свет/темнота. Используйте воздух, отфильтрованный HEPA, если он доступен.
   3. Обеспечьте 72-часовую акклиматизацию мышей с постоянным доступом к пище и воде, сводя к минимуму взаимодействие с человеком для снижения стресса.
2. Синхронизация эстрального цикла
   1. Собрать подстилку, содержащую мужские феромоны; Вводите его в женские клетки на 48 ч.
3. Цитология влагалища
   1. Проведите цитологическое исследование влагалища на следующее утро.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мазок необходимо проводить в одно и то же время суток, обычно в 9:00 утра.
      1. Заранее подготовьте ватные палочки с двумя головками, автоклавный PBS, чашку Петри 35 мм и стеклянные предметные стекла. Раздайте 10 мл PBS в чашке Петри. Погрузите один конец ватного тампона в PBS, чтобы он впитал жидкость.
      2. Аккуратно выньте одну мышь из клетки и положите ее на крышку пустой клетки.
      3. Обхватите хвост большим и указательным пальцами одной руки, а другой рукой возьмите смоченный ватный тампон и аккуратно введите его во влагалище мыши. Осторожно введите кончик палочки тампона на глубину примерно 1,0 см во влагалище мыши. Вращайте тампон осторожно, сохраняя при этом угол около 45° к длинной оси тела животного.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Медленное вращение тампона во время введения может способствовать более гладкой процедуре и свести к минимуму потенциальную стимуляцию шейки матки.
      4. Аккуратно удалите клетки из просвета и стенок влагалища, непрерывно вращая тампон, а затем осторожно извлеките тампон.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса следите за тем, чтобы тампон постоянно вращался, стараясь при этом не соприкасаться с окружающими волосками. После этого осторожно извлеките тампон, чтобы избежать возможного загрязнения.
      5. Перенесите собранные клетки, аккуратно прокатив кончик тампона по чистому стеклянному предметному стеклу с предварительной маркировкой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Палочку для тампона следует выбросить после переноса клеток на предметные стекла, и для каждого животного следует использовать новую.
      6. Осмотрите предметные стекла под микроскопом, чтобы обнаружить ороговевшие эпителиальные клетки. Обратите внимание на равномерное присутствие ороговевших эпителиальных клеток в цитологии влагалища, что указывает на стадию течки. Делайте фотографии и записывайте наблюдения.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии соответствующих знаний окрашивание вагинальных мазков не требуется. Однако, если экспериментатор не может «прочитать» мазки, не испачкав их, то это необходимо.

2. Установление модели эндометриомы

Примечание: Отбирайте мышей только на стадии течки в качестве доноров и реципиентов в модельном учреждении. Проводя эксперименты на одной мыши, убедитесь, что она находится вне поля зрения других и что она не будет повторно введена в компанию других животных до полного выздоровления. Схему генерации модели можно найти на рисунке 1.

1. Препарирование донорской ткани
   1. Успокоите мышей-доноров комбинацией кетамина (75 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Усыпить мышей-доноров путем транслокации шейки матки под наркозом.
   2. Продезинфицируйте область живота тампоном из 70% этанола.
   3. С помощью стерильных хирургических ножниц сделайте разрез (1 см) по средней линии брюшины, чтобы обнажить мышечный слой. Выберите еще одну пару хирургических ножниц, чтобы разрезать мышечный слой и открыть тазовую полость.
   4. Закройте кончики щипцов и аккуратно приподнимите кишечник с помощью тупой центральной части.
   5. Определите местоположение матки и тканей яичников. Проведите стерильное вскрытие всего рога матки, включая оба рога матки, убедившись, что приблизительный размер удаляемого фрагмента составляет ~1,5 см в длину. Поместите вырезанные салфетки в чашку Петри, содержащую PBS, и удалите лишние жировые ткани.
   6. Поминутно рассеките ткани на кусочки по 1 мм³ с помощью стерилизованного скальпеля. Поддерживайте влажность тканей, периодически добавляя PBS.
2. Процедура трансплантации
   1. Обезболите мышей-реципиентов смесью кетамина (75 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
   2. Нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции. Поместите мышей в лежачем положении на стерильную хирургическую доску.
   3. Определите место хирургического вмешательства, осторожно манипулируя задними лапами мыши, при этом под кожей прощупывается костный выступ. Эта выпуклая точка, хорошо видимая через кожу, служит надежным анатомическим маркером для яичников мыши-реципиента во время хирургической процедуры.
   4. Выбрейте место операции, убедившись, что 150% площади вокруг него очищено от шерсти. Затем продезинфицируйте кожу чередующимися раундами бетадина и 70% алкоголя не менее 3 раз. Используйте стерильную хирургическую простыню, чтобы предотвратить контакт между тканями, стерильными инструментами и швами с остатками шерсти. Наконец, сделайте точный боковой разрез (3-5 мм) в заранее определенном месте операции.
   5. Стабилизируйте яичник с помощью недоминантных щипцов для рук. Осторожно введите 100 мкл PBS в яичниковую сумку, наблюдая за небольшим расслоением.
   6. Создайте крошечную щель в бурсе. Пересадите фрагменты ткани матки (1 мм³) с помощью микрощипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерной набивки, чтобы предотвратить давление на окружающие ткани.
   7. Для фиктивной операции повторите все шаги, кроме шага 2.2.6.
3. Послеоперационный уход
   1. Сшить мышечные слои рассасывающимися нитями (например, 5-0 викрилом) и кожу нерассасывающимися нитями (например, 5-0 нейлоном).
   2. Поместите мышь на грелку, установленную на 37 °C, пока не вернется полное сознание. Следите за дыханием и дождитесь, когда конечности станут розовыми.
   3. Вводите бупренорфин (0,1 мг/кг, подкожно) при боли каждые 12 ч в течение 48 ч. Проверяйте наличие признаков боли, инфекции или дистресса каждые 8 часов в течение первых 24 часов, а затем 3 раза в день в течение следующих 3 дней.
      Примечание: Животное не оставляют без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание настолько, чтобы поддерживать лежачее положение на грудине.

3. Валидация модели

1. Валовая валидация
   1. Через 4 недели обезболите мышей-реципиентов комбинацией кетамина (75 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Затем под глубокой анестезией усыпляют мышей, выполняя транслокацию шейки матки.
   2. Выполните разрез по средней линии и обнажите брюшную полость для осмотра органа.
   3. Извлеките яичники с видимыми поражениями и сделайте фотографии.
   4. Тщательно осмотрите на предмет посторонних эндометриоидных образований.
2. Гистологическая валидация
   ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с присутствием в гистологических экспериментах потенциально раздражающих пахучих растворителей, его следует проводить в вытяжном шкафу.
   1. Зафиксируйте яичники вместе с очагами поражения в 10% нейтрально-буферизованном формалине.
   2. Обрабатывайте ткани в соответствии с теми же процедурами, которые описаны в Adeniran et ^al.37, включая выделение тканей, фиксацию и встраивание.
   3. Последовательно разрезают ткани толщиной 4-5 мкм, плавают в водяной бане при 45 °C и устанавливают на стеклянные предметные стекла. Четко обозначьте слайды номером мыши, стороной завязи и номером раздела. Сушите в течение ночи при температуре 37 °C.
   4. Окрашивание PAS-гематоксилином
      1. Депарафинизация: Поместите предметные стекла в ксилол или заменитель ксилола, чтобы удалить парафин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, вам придется выполнить этот шаг пару раз.
      2. Регидратация: Постепенно увлажняйте участки тканей, помещая предметные стекла в ряд с уменьшающейся концентрацией этанола (100%, 95%, 80%, 70%).
      3. Периодическая кислотная обработка: Покройте участки тканей 1% периодическим раствором кислоты и оставьте на 5-10 минут при комнатной температуре.
         Примечание: На этом этапе гликолевые группы ткани окисляются до альдегидных групп, что позволяет провести реакцию с реагентом Шиффа и образовать пурпурно-розовое пятно, указывающее на структуры яичников.
      4. Тщательно промойте предметные стекла дистиллированной водой, чтобы удалить остатки периодической кислоты.
      5. Окрашивайте участки ткани раствором Шиффа в течение 15 минут.
      6. Промойте предметные стекла сначала в горячей проточной воде из-под крана, чтобы удалить излишки пятна, затем в дистиллированной воде.
      7. Срезы нанести в противовес 1 г/л гематоксилина Мейера в течение 2-3 мин.
      8. Промойте горки в проточной воде из-под крана в течение 2-3 минут.
      9. Нанесите реагент Bluing в течение 30 с.
      10. Промойте горки в дистиллированной воде.
      11. Постепенно обезвоживайте срезы, погружая их в концентрацию этанола с возрастающей концентрацией (70%, 80%, 95% и 100%).
      12. Погрузите срезы в очищающий агент (например, ксилол), чтобы сделать их прозрачными.
      13. Нанесите монтажный материал на секции на предметных стеклах и аккуратно наденьте защитный стекло на секции, убедившись, что на них нет пузырьков воздуха. Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе в кожухе, чтобы облегчить затвердевание монтажной среды.
   5. Рассмотрите под световым микроскопом. Документально подтвердить наличие эндометриальных желез, стромы и геморрагических кист, подтверждающих эндометриоз в яичнике.

Результаты

Успешное создание OMA
Из 12 мышей, подвергшихся протоколу трансплантации, у 10 наблюдались характерные поражения OMA, как на валовом, анатомическом, так и на гистологическом уровне, что соответствует уровню успеха 83%. При общем обследовании были выявлены заполне...

Обсуждение

Распространенность ОМА среди женского населения мира подчеркивает критическую проблему здравоохранения³⁸. Помимо общих симптомов эндометриоза, ОМА создает дополнительные проблемы для фертильности, включая сильную тазовую боль, возможность перекрута я...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe with 25 G needle	BD Biosciences	301320
10 mm Tissue culture dish	FALCON	353001
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
10x phosphate buffered saline (PBS) buffer	Fisher Scientific	AM9625
30 G needle	BD Biosciences	305107
5-0 black braided silk non-absorbable suture	Ethicon Inc.	W500H
70% Ethanol
Adhesive microscope slides	Marienfeld	810401
Buprenorphine Injection	Med-Vet International	RXBUPRENOR5
Double-headed cotton swab	SANYO Co., LTD.	HUBY-340
Fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Ketamine	Alfasan International b.v	2203095-08
Microtubes	Corning	MCT-150-C
Needle holder	Excelta Corporation	2827-NH-35-SE-ND
Ophthalmic ointment	Major Pharmaceuticals	10033691
Periodic Acid Schiff (PAS) Stain Kit	Abcam	Ab150680
Powder free sterile gloves	Fisher Scientific	19020558
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	15-197-700A
Size 3 scalpel	Fisher Scientific	22-079-657
Small serrated semi-curved forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135
Small surgical scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5850
Standard light microscope			For evaluating vaginal cytology smears and histological analysis.
Steel scalpel blades #10	B.Braun	BB510
Sterile gauze	MEDICOM	HMWS 077
Sterilized pyrex glass Petri dishes	Corning	70160-101
Thermoregulated electric pad
VICRYL RAPIDE (polyglactin 910) absorbable Suture	Ethicon Inc.	W9918
Xylazine	Alfasan International b.v	2110333-10