Синтез гранул с высоким содержанием масла черного тмина, альгината, чувствительных к pH с использованием метода электронапыления

Резюме

Представлена методика с использованием высокого электрического напряжения и целенаправленной эмульсии, наполненной активными ингредиентами, для получения pH-чувствительных, однородных микрогранул.

Аннотация

Масло черного тмина (BSO), полученное из семян растения Nigella sativa , привлекло внимание благодаря своим потенциальным противораковым свойствам, особенно в контексте рака толстой кишки. Его активное соединение, тимохинон, может помочь ингибировать рост раковых клеток и индуцировать апоптоз в клетках рака толстой кишки. Кроме того, противовоспалительное и антиоксидантное действие масла черного тмина может способствовать улучшению окружающей среды кишечника, потенциально снижая риск развития рака. Таким образом, в этом исследовании были синтезированы pH-чувствительные альгинатные гранулы для доставки BSO в толстую кишку контролируемым образом без высвобождения препарата при pH 1,2 (желудок), тем самым обеспечивая четко определенную схему высвобождения при pH 6,8. Использование технологии электрораспыления улучшает производительность процесса, упрощая составление мелких, однородных гранул с более высокой скоростью набухания и диффузии в желудочно-кишечной среде.

Разработанные гранулы характеризовались тестом на прочность мукоадгезивного слоя ex-vivo , размер гранул, фактор сферичности (SF), эффективность инкапсуляции (EE), сканирующий электронный микроскоп (SEM), поведение набухания in vitro (SB) и высвобождение препарата in vitro в кислых и буферных средах. Все эти изготовленные бусины показали скромные размеры 0,58 ± 0,01 мм и сферическую форму 0,03 ± 0,00 мм. Рецептура показала многообещающие плавающие и высвобождающие свойства in vitro. При очень низком кумулятивном проценте гранул, ЭЭ масла 90,13% ± 0,93% было высоким, а исследование выпуска показало более 90% pH 6,8 с хорошим плавающим характером в желудке. Кроме того, бусины были равномерно распределены по всему кишечнику. Подход к электрораспылению, используемый в этом протоколе, может быть воспроизводимым, что дает стабильные результаты. Таким образом, этот протокол может быть использован для крупномасштабного производства в целях коммерциализации.

Введение

Черный тмин, и особенно БСО, веками использовался для лечения широкого спектра заболеваний благодаря своим хорошо известным лечебным свойствам. Тимохинон, пожалуй, является одним из самых важных фитохимических веществ, обнаруженных в BSO¹. В последние годы исследователи изучали потенциальные терапевтические преимущества тимохинона in vivo и in vitro, получив эмпирические доказательства в поддержку использования BSO. Антигипертензивные, антибактериальные, антигистаминные, противогрибковые, обезболивающие, антидиабетические, гиполипидемические и противовоспалительные свойства были продемонстрированы в этих исследованиях для БСО, которые могут быть использованы для лечения таких симптомов, как экзема, высокое кровяное давление, астма, кашель, головная боль, грипп, лихорадка, противораковые средства, головокружение и активность ^2,3.

Нанесение относительно тонких покрытий на мелкие капли жидкостей и дисперсий или частиц твердого материала известно как микрокапсулирование. Когда дело доходит до масла, микрокапсулированное масло обычно довольно ценно, потому что некоторые формы масла, такие как BSO, считаются питательными продуктами и обладают лечебными^{свойствами.} Однако добавление масел непосредственно в матрицу пищи может привести к испарению, что может быстро привести к исчезновению активности в результате воздействия кислорода и ультрафиолетового излучения⁵. Кроме того, отсутствие контроля над скоростью выделения масел приводит к немедленному и кратковременному эффекту. Создание полимерного покрытия вокруг эфирного масла с помощью микрокапсулирования или микросферификации является одним из методов преодоления этих недостатков⁶.

Микрокапсулы, также известные как микросферы, защищают масла от вредных условий окружающей среды⁷. Этот процесс широко используется для повышения эффективности лекарств, сохранения содержания лекарств, обеспечения возможности выпуска таблеток с замедленным высвобождением, улучшения маскировки вкуса, уменьшения потери вкуса в течение срока годности продукта, продления вкусовых ощущений во рту и отделения несовместимых ингредиентов в одной дозировке⁸. Микрокапсулирование также помогает поддерживать метаболическую абсорбцию, контролировать скорость выделения масла и поддерживать соответствующие концентрации для получения желаемого результата в определенном месте⁹.

Электрогидродинамическая инкапсуляция является простым и адаптируемым методом. Активное вещество находится во внутреннем ядре микрокапсулы, которая состоит из внешней оболочки. В связи с этим он имеет достаточно прочную матрицу, гарантирующую более эффективную диссеминацию активного компонента, а не четко определенного ядра. Перед сферициклизацией активное вещество и полимерный раствор должны быть соединены для получения микросфер⁹. С другой стороны, поскольку масло летучее, его микрокапсулирование может быть чрезвычайно сложным и требует тщательного контроля температуры.

Существуют различные методы капсулирования масел. Например, некоторые масла необходимо инкапсулировать при низких температурах, чтобы предотвратить разрушение или испарение их биологически активных компонентов. Для создания микро- и наноразмерных^{структур исследователи широко} изучали электрогидродинамическую распыленность (ЭГДА). В этом смысле условия обработки, которые включают скорость потока, приложенное напряжение и размер сопла, а также свойства расстояния сбора полимерного раствора, являются двумя основными факторами, которые должны быть приняты во внимание для получения желаемого размера или морфологии частиц^11,12.

В этом исследовании альгинаты — тип встречающихся в природе полисахаридов, пригодных для перорального приема внутрь — были использованы для инкапсуляции BSO. Бурые водоросли содержат альгинат, анионный полимер, который встречается в природе. Он состоит из двух мономерных структур: α-L-гулуроновой (G) и 1-4βD-маннуроновой (M) кислоты¹³. Его полимер не токсичен¹⁴, имеет высокую степень биосовместимости, недорог и эффективно разлагается¹⁵. Поэтому он часто используется в биотехнологическом и инженерном секторах.

Альгинаты являются предпочтительным материалом для инкапсуляции методом ионного гелеобразования, поскольку они могут создавать сшитую структуру между G-группами различных альгинатных цепей, образуя ионные связи с двухвалентными катионами, такими как ионы Sr²⁺, Ca²⁺ или Zn²⁺. Процесс гелеобразования можно адекватно охарактеризовать с помощью модели яйцеклетки, которая ограничивает двухвалентный катион двумя карбоксильными группами на параллельных молекулах альгината. Было высказано предположение, что гидрогелевые характеристики гранул альгината натрия могут регулировать высвобождение макромолекул и малых молекул. Гранулы альгината натрия могут прилипать к слизистой оболочке кишечника в течение длительного периода времени благодаря своим слизисто-адгезивным свойствам. Кроме того, альгинат представляет собой защитный экран, который может защищать масла от внешних элементов, таких как кислые среды¹⁶, и переносить масла в каналы доставки желудочно-кишечного тракта¹⁷. С тех пор он был использован в исследованиях для помощи в местно-специфическом введении лекарственного препарата в ткани слизистых оболочек^18,19.

Электрогидродинамический подход был использован в данном исследовании для изучения жизнеспособности эмульгирования коммерческих масел для создания капсул²⁰. Здесь был использован электрогидродинамический подход для генерации и анализа микросфер²⁰, нагруженных альгинат-BSO. В этом исследовании оценивался ряд других факторов, включая SF микросфер, ex-vivo, слизистые адгезивные свойства, EE%, внешний вид, распределение по размерам и дзета-потенциал; инфракрасная спектроскопия с аттенуированным полным отражением и преобразованием Фурье (ATR-FTIR) была использована для проверки химической совместимости²⁰.

протокол

1. Приготовление эмульсии альгинат-БСО

1. Диспергируйте 10% по мас.% BSO в 1% по мас.v раствору альгината натрия, содержащему 1, 3 и 5% по объему лецитина, в стакане объемом 50 мл.
2. Получить наноэмульсию можно с помощью ультразвукового гомогенизатора. Установите уровень мощности на 20%. Запустите гомогенизатор в течение 55 с, нажав кнопку «Пуск », чтобы завершить процесс.

2. Характеристика альгинат-BSO эмульсии

1. Анализ дзета-потенциала и распределения частиц по размерам
   1. Возьмите 0,1 мл свежеприготовленной эмульсии в стеклянную мензурку объемом 25 мл и разбавьте ее 9,9 мл дистиллированной воды.
   2. Возьмите 2,5 мл этого разбавленного раствора в кварцевую кювету объемом 3 мл и поместите кювету в измерительную камеру.
   3. Откройте крышку и поместите кювету внутрь устройства, убедившись, что кювета правильно ориентирована по отношению к траектории светового луча. Нажмите на значок измерения .
   4. Выньте кювету. Извлеките образец или утилизируйте его надлежащим образом.
   5. Сохраните данные в виде pdf-файла в личной папке для дальнейшего использования.
2. Определение стабильности эмульсии (ES)
   1. Возьмите 5 мл свежеприготовленной эмульсии в центрифужных пробирках объемом 10 мл. Центрифугируйте эмульсии (n = 3) в течение 5 мин при 894 × г.
   2. С помощью уравнения (1) определите ЭС на основе положения раздела раздела фаз.
      (1)
      Где Vemul – объем оставшейся эмульсии после центрифугирования, а Vinitial – объем исходной эмульсии.
3. Подготовка швов
   1. Альгинатные бусины БСО
      1. Приготовьте альгинатные шарики BSO с помощью технологии электронапыления, называемой EHDA. Используйте массовую эмульсию BSO, состоящую из 10% BSO, 1% альгината натрия и 3% раствора лецитина.
      2. Используя шприцевой насос для регулирования скорости потока, загрузите эмульсию в пластиковый шприц объемом 10 мл и протолкните ее через иглу 22 G. Прикрепите кончик иглы к положительному электроду высоковольтного источника питания.
      3. В качестве коллектора используйте заземленный стакан с 50 мл 1% по мас.мас.хлорида кальция (желирующая ванна). Чередуйте расход капель от 1 мл/мин до 3 мл/мин при напряжениях 3, 5 и 7 кВ, сохраняя расстояние 10 см над поверхностью раствора хлорида кальция.
      4. Чтобы подтвердить полное гелеобразование, оставьте шарики в желирующей ванне на 30 минут, перемешивая их. Используйте фильтр из нержавеющей стали, чтобы удалить шарики из желирующей ванны, и промойте собранные шарики сверхчистой дистиллированной водой.
      5. Дайте шарикам высохнуть в течение 16 часов при комнатной температуре на лабораторном столе. Используйте Уравнение (2) для расчета процентного выхода бусин.
         (2)
   2. Альгинатные шарики без BSO
      1. Приготовьте 1% w/v раствор альгината натрия. Добавьте в раствор лецитин в концентрациях 1%, 3% и 5% мас.v. Тщательно перемешайте раствор до полного растворения лецитина.
      2. Используйте раствор из шага 2.3.2.1 для приготовления альгинатных шариков, не содержащих BSO, как описано в шагах 2.3.1.2-2.3.1.5. Рассчитайте урожайность с помощью уравнения (2).

3. Характеристика швов

1. Определение размера и формы
   1. Чтобы определить размер и форму бусин, используйте анализатор изображений. Сфотографируйте с помощью цифровой камеры влажные и высушенные бусины.
   2. Затем измерьте диаметр борта с помощью предустановленной шкалы прибора. Используя значения диаметров, рассчитаем SF из полученных значений диаметров с помощью уравнения (3):
      СФ = (3)
      Где Dmax представляет собой наибольший диаметр, проходящий через центр бусины (в мм), в то время как Dper относится к диаметру, который перпендикулярен Dmax и проходит через центр бусины (в мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нулевое значение SF обозначает идеально сферическую бусину, а возрастающие значения SF означают большее отклонение от сферической формы. Кроме того, бусины считаются сферическими, если их SF составляет 0,05 или ниже.

4. Определение EE%

1. Разложите шарики в фосфатно-солевом буфере (PBS), чтобы вернуть их в эмульсию. Измерьте поглощение полученной эмульсии на длине волны 600 нм с помощью УФ-видимого спектрофотометра.
2. Используйте значение абсорбции для представления мутности эмульсии. Создайте стандартную кривую с использованием известного количества BSO в эмульсии.
3. Рассчитаем EE% с помощью уравнения (4):
   (4)

5. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте SEM для наблюдения за микроструктурой и морфологией поверхности альгинатных шариков BSO.

1. Чтобы осмотреть внутреннюю часть высушенных бусин, отрежьте несколько из них. Нанесите нарезанные бусины на алюминиевые пряди и наклейте их с помощью углеродных клейких лент.
2. Нанесите покрытие на шарики с помощью модуля напыления углерода в вакуумном испарителе в атмосфере аргона. Нанесите на углеродное покрытие толщиной 100 Å и 50 Å.
3. Получение изображений покрытых валиков в условиях высокого вакуума с помощью ускорителя напряжения от 10 кВ до 15 кВ.

6. Определение лекарственного взаимодействия со вспомогательным веществом с помощью ATR-FTIR

1. Установите значения инструментальной волны в диапазоне от 4 000 ^см-1 до 400 ^см-1 , используя окружающий воздух в качестве фона и разрешение 1 ^см-1. Смотрите Дополнительный файл 1.
2. Запишите спектры БСО, альгината натрия, лецитина, хлорида кальция, гранул без БСО, гранул альгината-БСО и физической смеси активного ингредиента и вспомогательных веществ (альгината натрия, лецитина, хлорида кальция и БСО) отдельно.
   1. Поместите образец (5-10 мг) на место отбора проб. Отрегулируйте 20 сканирований, разрешение 4, усилие 80, прижимной рычаг с плоским наконечником. Убедитесь, что для параметра Автоприращение по-прежнему установлено значение Пусто , чтобы спектр автоматически сохранялся в нужной папке.
   2. Чтобы начать измерение образца, нажмите кнопку [Образец] . После выбора [Образец], поскольку периода ожидания нет, убедитесь, что образец готов, а давление зажима уменьшено. Анализируйте все образцы по отдельности. Индивидуально анализируйте все записанные спектры с помощью программного обеспечения для спектроскопии.

7. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Термические свойства и совместимость шариков, загруженных BSO, были исследованы с помощью DSC (Дополнительный файл 1).

1. Запечатайте бусины весом ~3,20 мг в обычную алюминиевую кастрюлю. Образцы нагревают со скоростью 10 °С/мин при анализе в диапазоне температур 50-350 °С под потоком азота, протекающего со скоростью 20 л/мин.

8. Характеристики набухания бусин

1. Приготовьте 100 мг высушенных шариков альгината-BSO.
2. Приготовьте имитированную кишечную жидкость (SIF) и имитированную желудочную жидкость (SGF) в чистом сухом емкости для смешивания подходящего размера - 6 л, 10 л или 25 л. Добавьте очищенную воду примерно на 33% от требуемого объема - 2 л, 3 л или 8 л, и перелейте содержимое флакона с концентратом в сосуд. Промойте бутылку очищенной водой и добавьте ополаскиватели и очищенную воду в емкость для смешивания для получения необходимого объема; Тщательно перемешайте. Измерьте pH и действуйте, если это не соответствует спецификации; При необходимости отрегулируйте pH.
3. Погрузите шарики в 50 мл среды, содержащей имитированную кишечную жидкость (SIF) и имитируемую желудочную жидкость (SGF). Поддерживать условия в течение 2 ч при температуре 37 ± 0,5 °C.
   1. Удалите надутые шарики и отфильтруйте их через металлическую сетку с заранее заданными интервалами 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 и 120 минут или более. Используйте бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость из набухших шариков.
   2. Измерьте вес вытертых бусин с помощью электронных аналитических весов. Определите процент индекса набухания (%СИ) с помощью уравнения (5):
      (5)

Результаты

Приготовление альгинатных микрогранул с нагрузкой на BSO
На рисунке 1 представлена экспериментальная установка для получения альгинатных микрогранул, загруженных BSO. Количество используемого лецитина оказывало значительное влияние на ста...

Обсуждение

С помощью процесса EHDA были созданы альгинатные микрогранулы, загруженные BSO, в качестве pH-чувствительного носителя. Сеть шариков демонстрировала pH-зависимое набухание и поведение высвобождения лекарств из-за обильного присутствия групп карбоновых кислот. Было выявл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Centrifuge Tubes	Globe Scientific	22-171-624
22 G needle	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	CAD4172
3 mL quartz-cuvette	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	Z276669
50 mL beaker
Aluminum stubs
An electronic analytical balance
ATR-FTIR	Bruker Malaysia Sdn Bhd, Kawasan Perindustrian Temasya, 40150 Shah Alam, Selangor, Malaysia.
Black seed oil	IKOP Pharmaceutical Ltd. (IKOP, Faculty of Pharmacy, IIUM, 25200 Kuantan, Pahang, Malaysia	B182111	Active ingredient
Calcium chloride dehydrate, CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	21074	Gelling agent
Carbon adhesive tapes
Centrifuge
Differential scanning calorimetry
Digital   camera
Grounded beaker
High guluronic acid content Sodium alginate (mw. 97,000) with medium viscosity (40 – 100 mPa s)	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W201502	Polymer
High voltage power supply
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W292912	ATR-FTIR cleaning purpose
Lecithin	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	P7568	Surfactant
Microscope
Paper towel
Scanning electron microscopy
Simulated gastric fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	1651	Release media and swelling media
Simulated intestinal fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	84082-64-4	Release media and swelling media
Spectroscopy software
Stainless-steel filter
Syringe pump	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Ultrapure distilled water	Supplied by institutional lab
Ultrasonic homogenizer	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
UV-vis spectrophotometer.
Vacuum evaporator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Voltage accelerator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Zetasizer Nano-ZS	(Malvern Zetasizer Nano series Nano-S and Nano-Z, Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)