Включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и поместите предметное стекло на держатель предметного стекла. Для визуализации и получения изображения выберите объектив 20X. В конфокальном программном обеспечении выберите режим последовательного сканирования, чтобы избежать перекрестных помех между BODIPY 493/503 и DAPI.
Затем возбудите матрицу BODIPY 493/503 с помощью 488-нанометровой линии аргонового лазера и окрашивание DAPI с помощью 405-нанометровой лазерной линии. Установите диапазоны излучения от 493 до 589 нанометров для BODIPY и от 410 до 464 нанометров для DAPI. Затем настройте параметры микроскопа, отрегулировав размеры кадра, скорость сканирования и усреднение, которое включает в себя двукратную битовую глубину равной 12 битам, направление как двунаправленное, цифровой зум области сканирования минус один и точечное отверстие минус одна единица площади.
Отрегулируйте настройки усиления и цифрового усиления. Убедитесь, что нет насыщенных пикселей, на что указывает индикатор диапазона. После точной идентификации липидных капель получите изображение с помощью каналов BODIPY и DAPI.
Чтобы создавать изображения с большой площадью, переключитесь на 10-кратный субъективный объектив. Затем активируйте режим сканирования плиток и настройте его для создания мозаичных изображений размером пять на пять. Чтобы создать 3D-изображения и ортогональные виды, нанесите каплю иммерсионного масла на верхнюю часть покровного стекла и замените линзу объектива на линзу 40X.
Выберите режим Z-стека. Отрегулируйте плоскость Z, чтобы определить первую и последнюю позиции для захвата изображения, обеспечив толщину оптического среза примерно 0,5 микрона для захвата всех капель в фокусе. Выберите ортогональный модуль и создайте ортогональные виды.
Получите 3D-изображения, выбрав модуль 3D в режиме рендеринга прозрачности. После получения изображения начните обработку и анализ одноплоскостных изображений с помощью CellProfiler. Загрузите изображения в формате TIF, нажав на режим изображений в верхнем левом углу интерфейса CellProfiler.
Используйте модуль «Имена и типы» для сортировки изображений, окрашенных каплями BODIPY и ядрами DAPI, на основе имен файлов. Для анализа липидных капель используйте только изображения, окрашенные BODIPY. Инициируйте построение конвейера, щелкнув «Настроить модули» и выбрав цвет серого модуля, чтобы преобразовать изображения в оттенки серого.
Затем, используя модуль идентификации первичных объектов, определите липидные капли размером от 6 до 300 пикселей и пороговый поправочный коэффициент, равный единице, для обнаружения липидных капель на изображениях в оттенках серого. Чтобы измерить интенсивность пикселей идентифицированных липидных капель, добавьте модуль измерения интенсивности объекта. Включите дополнительный модуль объектов фильтрации, чтобы гарантировать, что количественно оцениваются только самые сильные сигналы, в то время как менее интенсивные сигналы исключаются из окончательного анализа липидных капель.
Затем, чтобы измерить липидные капли, связанные с выходными данными, добавьте модуль формы размера объекта измерения. Затем добавьте модуль наложения контуров, чтобы наложить идентифицированную каплю на исходное изображение и, таким образом, убедиться, что сегментация выглядит точно и на необработанном изображении. После этого добавьте модуль экспорта в электронную таблицу и нажмите кнопку анализа изображений в левом нижнем углу.
По сравнению с контрольной группой, у животных, получавших HFD, наблюдался выраженный дислипидемический профиль и незначительное повышение уровня циркулирующих триглицеридов. Изображения на больших площадях показали повышенное содержание липидных капель в печени животных, получавших HFD. Анализ с помощью CellProfiler выявил увеличение количества капель липидов в печени, повышенную интенсивность флуоресценции BODIPY, соотношение площади 360% и больший диаметр.
Распределение по размерам у животных, получавших HFD, выявило увеличение макровезикулярных липидных капель печени более чем на девять микрон и уменьшение микровезикул менее чем на три микрона.
