Включите все компоненты настройки сбора данных для измерения флуорометрии. Поместите 35-миллиметровую стеклянную нижнюю тарелку, содержащую диссоциированные мышечные волокна, на столик микроскопа. Осторожно удалите питательную среду пипеткой объемом 1 000 микролитров и замените ее 2 миллилитрами раствора Рингера комнатной температуры.
Используя механический или моторизованный манипулятор, поместите два платиновых провода перпендикулярно дну тарелки. Убедитесь, что клеммы электродов выровнены относительно продольной оси волокна и на расстоянии нескольких миллиметров от концов волокна. Отрегулируйте положение электрода, вращая тарелку или перемещая каждый электрод, если он установлен на независимом микроманипуляторе.
Включите проходящий свет и найдите волокна в поле зрения с помощью объектива 20X. Переместите куб фильтра EGFP в световой путь. После выключения проходящего света активируйте 488-нанометровый возбуждающий свет с помощью светового затвора с дистанционным управлением.
Чтобы идентифицировать положительные волокна EGFP, центрируйте волокна с самым ярким сигналом EGFP в середине поля зрения. Используйте диафрагму, расположенную на пути возбуждающего света, чтобы сфокусировать возбуждающий свет в определенной области волокна. Это позволяет регистрировать сигнал там, где сигнал EGFP CaV1.1 максимален.
Отрегулируйте положение волокна с помощью механического столика, чтобы оно соответствовало световому пути диафрагмы, и сохраните местоположение волокна XY. Вернувшись к первой сохраненной локализации, установите длительность двух последовательных импульсов стимуляции на 1 миллисекунду, амплитуду на 20 вольт, а полярность импульсов на переменную. Затем используйте ручной триггерный переключатель, чтобы доставить два последовательных импульса.
Во время стимуляции наблюдайте два концентрических однородных сокращения волокон в ответ на два импульса противоположной полярности. Если сокращение не наблюдается или наблюдается только одно концентрическое сокращение с импульсами переменной полярности, откажитесь от волокон из остальной части эксперимента. Добавьте 2 микролитра 10-миллимолярного раствора MTS 5 TAMRA непосредственно в чашку и аккуратно перемешайте пипеткой объемом 1 000 микролитров.
Инкубируйте в течение четырех-пяти минут, чтобы обеспечить диффузию флуоресцентной молекулы тиола в просвет поперечной системы канальцев. С помощью полевой стимуляции применяйте биполярные повторяющиеся стимуляции, чтобы вызвать последовательные потенциальные поезда действия со скоростью 50 герц в течение 300 миллисекунд каждые 1 секунду в течение 5 минут. Удалите красящий раствор с посуды пипеткой объемом 1 000 микролитров.
И замените его 2 миллилитрами раствора звонка комнатной температуры. Дайте окрашенному волокну восстановиться после протокола окрашивания не менее 10 минут. После повторной оценки состояния волокна и электрической активности с помощью двух чередующихся импульсов переместите фильтрующий куб MTS 5 TAMRA в световой тракт и активируйте 533-нанометровый возбуждающий свет с помощью светового затвора с дистанционным управлением, чтобы визуально подтвердить окрашивание волокон.
Затем, используя сохраненное местоположение на моторизованной сцене, поместите волокно в середину поля с кубом фильтра MTS 5 TAMRA, диафрагмой и объективом для погружения в масло 60X. После переориентации платиновых проводов стимуляции поля на каждом конце волокна выровняйте провода на главной оси волокон по прямой линии и расположите их на расстоянии пяти миллиметров друг от друга, так, чтобы волокно находилось в центре. В программном обеспечении сбора данных выберите протокол, который будет использоваться для сбора данных.
Этот шаг контролируется только компьютером и запускает все последующие устройства для электрической стимуляции и управления затвором светового пути. Для каждого протокола минимизируйте общее время сбора данных, насколько это возможно, чтобы избежать обесцвечивания сигнала, но дайте несколько десятков миллисекунд светового освещения и сбора сигнала до первой электрической стимуляции для записи базовой линии. Запустите протокол, нажав «Выполнить».
Записанный сигнал автоматически выводится на экран. Малая амплитуда сигнала и быстрое механическое сжатие волокна часто скрывают большую часть сигнала и отображают артефакт движения. Добавьте 1 микромоляр 100 миллимоляров и бензоилпаратолуолсульфаниламида в регистрирующий раствор, чтобы свести к минимуму договорные отклики и дополнительно различить сигнал, возникающий при движениях S4 из-за активации волокна.
Через несколько минут запустите тот же протокол во второй раз. Артефакт движения теперь удален, но небольшое изменение флуоресценции, соответствующее движению S4, осталось. Слегка переместите тарелку с помощью механического столика, чтобы получить сигнал из области без каких-либо волокон или мусора.
Запустите протокол в последний раз, чтобы записать фоновую флуоресценцию. Экспортируйте трассировки и используйте программу для работы с электронными таблицами, чтобы выразить сигнал в виде дельты f над f 0 в зависимости от времени и при необходимости применить коррекцию базовой линии. Здесь показаны примеры передаваемых и флуоресцентных изображений рассеченной и недиссоциированной мышцы, экспрессирующей конструкцию EGFP CaV1.1.
На этом рисунке показаны репрезентативные изображения мышечного волокна, экспрессирующего конструкцию EGFP CaV1.1 VS D3 до и после окрашивания MTS 5 TAMA. Этот краситель также окрашивает эндогенные цистеины нетрансфицированных волокон. Конфокальные изображения конструкции EGFP CaV1.1 VS D3 и окрашивания MTS 5 TAMRA показывают двухполосный рисунок, характерный для локализации CaV1.1 на поперечной системе канальцев мышечного волокна.
Здесь показана репрезентативная флуорометрическая запись в ответ на два стимула, измеренная с помощью фотодиода. Оба сигнала нормализуются по их минимальному значению и строятся как функция времени относительно их соответствующей деполяризации. Эти записи показывают, что фаза нарастания и время до пика сигнала одинаковы для обеих деполяризаций, наложенных на волокно.
