Функциональная сайт-направленная флуорометрия в нативных клетках для изучения возбудимости скелетных мышц

CaV1.1, член потенциал-зависимых ионных каналов, имеет четыре различных датчика напряжения. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что некоторые датчики напряжения вносят больший вклад в активацию рецептора рианодина или кальциевого тока. Мы стремимся иметь возможность точно определить роль каждого датчика напряжения в связи возбуждения-сжатия и активации кальциевых каналов.

Связь возбуждения-сокращения изучается с начала 50-х годов, но молекулярные детали того, как происходит этот процесс, до сих пор неизвестны. Недавний прогресс в цироэлектронной микроскопической структуре канала, характеристика нового вспомогательного белка CaV1.1, открытие альтернативного варианта сплайсинга каналов и идентификация болезнетворных мутаций возродили интерес к этой области. В нашей области используются многие методы, от классической электрофизиологии и молекулярной биологии до более новых методов, таких как криоэлектронная микроскопия, молекулярно-динамическое моделирование, целенаправленная деградация белка и функциональная сайт-направленная флуорометрия, а также инженерные клетки или модели животных.

В настоящее время топливо сталкивается с несколькими экспериментальными проблемами. В скелетных мышцах надлежащий трафик и связь между CaV1.1 и RyR1, наряду со многими регуляторными белками, имеют решающее значение для поддержки связи возбуждения-сокращения. Методы непосредственного изучения этих белково-белковых взаимодействий между CaV1.1 и RyR1 отсутствуют или неполны.

Лаборатория доктора Мартина Шнайдера десятилетиями работала над связью возбуждения-сокращения, характеризуя механизмы чувствительности напряжения в CaV1.1, высвобождение кальция и локализованные события высвобождения кальция, известные как искры кальция. В последнее время наша лаборатория внедряет новые оптические методы для исследования различных этапов связи возбуждения-сокращения и движения датчика напряжения в функционирующих мышечных клетках взрослого человека. Хотя это было сделано ранее в системе гетерологичной экспрессии, наш протокол теперь позволяет отслеживать конформационные изменения в датчиках напряжения CaV1.1 во время распространения потенциала действия в его родной среде.

Наша новая методика позволит нам исследовать точное движение датчика напряжения, необходимого для связи возбуждения-сжатия. Мы хотим знать, какие остатки заряда в каждом S4 имеют решающее значение для его функции, или именно каждый S4 транслоцируется, и вся эта транслокация связана с открытием CaV1.1 или активацией рецептора рианодина.