Внутри шкафа биобезопасности удалите мышиную жировую ткань стерильными щипцами. После удаления излишков PBS перенесите салфетку в другую чашку Петри и дважды вымойте в течение пяти минут каждый 10 миллилитрами раствора PBS AA. Добавьте 20 миллилитров приготовленного раствора коллагеназы в хрустальный стакан, содержащий фрагментированную ткань размером в один квадратный сантиметр и магнитный стержень.
Инкубируйте запечатанный стакан при температуре 37 градусов Цельсия при непрерывном перемешивании. Отфильтруйте гомогенат через отверстие из нержавеющей стали размером 40 меш 0,38 миллиметра Отфильтруйте на чашке Петри и соберите клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Осторожно суспензируйте стромально-васкулярную фракцию в 20 миллилитрах теплого дополненного ДМЭМ и центрифугируйте суспензию.
После выброса надосадочной жидкости аккуратно промойте клетки дважды 40 миллилитрами недополненной среды DMEM. Суспендируйте нёбо в пяти миллилитрах дополненного DMEM. Переложите суспензию в бутылку Т площадью 25 квадратных сантиметров и инкубируйте.
Трижды промойте ячейки пятью миллилитрами теплого PBS AA и дважды недополненным DMEM. Чтобы удалить любой клеточный мусор и немышиные клетки, добавьте пять миллилитров свежего, теплого дополненного DMEM и меняйте среду каждые три-четыре дня. Как только клетки достигнут слияния от 90 до 100%, добавьте один миллилитр теплого раствора трипсина ЭДТА в промытые клетки DMEM.
Инкубировать пять-семь минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Добавьте четыре миллилитра дополненного DMEM в отделившийся монослой ячейки и аккуратно дезагрегируйте суспензию. Суспендируйте клетки в пяти миллилитрах теплого дополненного ДМЭМ.
После центрифугирования и выбрасывания надосадочной жидкости аккуратно смешайте гранулы с одним миллилитром дополненного DMEM. Окрасьте клетки трипановым синим и пересчитайте их в камере Нойбауэра. Семенные ячейки в колбах Т-75.
Чтобы обеспечить образование колоний и высокую пролиферацию, наблюдайте морфологию клеток, окрашенных гематоксилином и эозином, под оптическим микроскопом. Окрашивание гематоксилином и эозином выявляет обширную цитоплазму с удлиненными продолжениями и обильными внутриклеточными микрофиламентами.
