В первый день после сшивания хроматина и сбора ядер у 5 000 молодых взрослых червей Caenorhabditis Elegans перенесите гранулы ядер, повторно взвешенные в 450 микролитрах чистой воды, в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Затем добавьте в него 60 микролитров 10-кратного буфера фермента рестрикции DPN2 и хорошо перемешайте. Инкубируйте образцы с 15 микролитрами 10% додецилсульфата натрия при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа при перемешивании.
Погасите реакцию, добавив 75 микролитров 20% тритона X 100 и инкубируя, как показано ранее. Выделите 10 микролитров из образца, как непереваренный контроль, и храните его при четырех градусах Цельсия. После добавления 400 единиц DPN 2 к остальной части образца инкубируйте его в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с перемешиванием для расщепления хроматина.
На второй день добавьте в образец дополнительно 200 единиц DPN 2. Чтобы завершить разложение сшитого образца, инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия с перемешиванием в течение четырех часов. Тепло инактивирует фермент рестрикции, инкубируя образец в течение 20 минут при 65 градусах Цельсия.
Если фермент не может быть инактивирован при нагревании, добавьте 80 микролитров 10% додецилсульфата натрия и инкубируйте. Затем добавьте 375 микролитров 20% Triton X 100 в образец и перемешайте путем завихрения. Отложите 10 микролитров аликвоты из образца в качестве контроля пищеварения.
Для лигирования хроматина перенесите образец в чистую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Отрегулируйте объем образца до 5.7 миллилитров с молекулярной водой и перемешайте путем завихрения. Затем добавьте 700 микролитров буфера 10 X T4-лигазы, а затем 60 единиц ДНК-лигазы T4 и инкубируйте образец в течение ночи при 16 градусах Цельсия.
На третий день приступайте к перевариванию белка и обратному сшиванию. Добавьте 30 микролитров 10 миллиграммов на миллилитр протеиназы K в образец 3C и инкубируйте при 65 градусах Цельсия в течение ночи с перемешиванием. Чтобы начать очистку библиотеки 3C на четвертый день, добавьте 30 микролитров 10 миллиграммов на миллилитр РНКазы А в образец и перемешайте путем завихрения.
После инкубации добавьте к образцам семь миллилитров фенилхлороформа и перемешайте встряхиванием. Центрифугируют образец в течение 15 минут при температуре 3, 270 г и комнатной температуре. Соберите и перенесите водную фазу в чистую коническую трубку объемом 50 миллилитров.
Добавьте равные объемы хлороформа и перемешайте образец путем встряхивания. После повторного центрифугирования образца, как показано на рисунке, перенесите водную фазу в другую чистую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте 7,5 миллилитров молекулярной воды, 35 миллилитров 100% этанола и семь микролитров одного миллиграмма на миллилитр гликогена.
Заморозьте правильно перемешанный образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Пока образец замерзает, начните очистку контрольных образцов, отрегулировав объем контрольных образцов до 500 микролитров с использованием молекулярной воды. Добавьте два микролитра по 10 миллиграммов на миллилитр РНКазы А и перемешайте, щелкнув пробиркой.
Затем добавьте один миллилитр фенилхлороформа в пробирки, содержащие контроль, и перемешайте, встряхивая. Центрифугируйте пробирки. После переноса водной фазы в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра добавьте равные объемы хлороформа.
Центрифуга, как было показано ранее, перед сбором водной фазы. К собранной водной фазе добавляют один миллилитр этанола и два микролитра по одному миллиграмму на миллилитр гликогена. После перемешивания образца путем встряхивания выдерживайте его при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Затем центрифугируют образец в течение 15 минут при температуре 3,270 G при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости добавьте 750 микролитров охлажденного 70%-ного этанола и центрифугу. Повторно суспендируйте высушенные на воздухе гранулы в 50 микролитрах молекулярной воды.
Приостановка может быть заморожена здесь, если не продолжить работу немедленно. Чтобы продолжить очистку образца 3C, извлеките образец из морозильной камеры и центрифуги при температуре 3 270 г в течение 30 минут. Добавьте 10 миллилитров охлажденного 70% этанола и разбейте гранулы ДНК.
После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости частично высушите образец на воздухе при комнатной температуре. Повторно суспендируйте гранулу в 150 микролитрах 10-миллимолярного триса HCL при pH 7,5 путем пипетки вверх и вниз для получения очищенной библиотеки 3C. КПЦР, выполненная на одном экспериментальном и двух контрольных образцах 3C, помогла получить данные об эффективности пищеварения.
Образец 3C имел эффективность пищеварения примерно 88% в семи протестированных геномных локусах.
