Начните с помещения замороженной диссоциированной суспензии эмбриональных клеток сердца, содержащей криофлаконы, на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на одну-две минуты. Добавьте в размороженную суспензию один миллилитр готовой среды, предварительно подогретой до 37 градусов Цельсия, и трижды перемешайте пипеткой. Затем переложите суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую 10 миллиметров теплой полной среды.
Пропустите всю клеточную суспензию через ситечко размером 30 микрометров и промойте ситечко одним-двумя миллилитрами теплой полной среды. Соберите поток через ту же коническую трубку. Далее центрифугируют пробирки при 300 G в течение пяти минут.
После удаления надосадочной жидкости промойте гранулу PBS и переложите клеточную суспензию в микропробирку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируйте клеточную суспензию и добавьте 100 микролитров предоставленных магнитных микрошариков в гранулированные ячейки. Гомогенизируйте суспензию пять раз с помощью широкого наконечника пипетки хрякового до 15 минут инкубации при комнатной температуре.
Тем временем промойте магнитную сепарационную колонну 500 микролитрами связующего буфера. После завершения инкубации разбавьте смесь суспензии клеток микрогранул, используя 500 микролитров связывающего буфера. Затем добавьте 0,6 миллилитра суспензии ячейки в колонну магнитной сепарации.
Соберите сточные воды живых клеток в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Затем промойте микропробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую клеточную суспензию, используя один миллилитр связывающего буфера. После промывки перенесите связующий буфер из микропробирки объемом 1,5 миллилитра в колонку и соберите сточные воды в ту же пробирку объемом 15 миллилитров.
Повторите промывку 1,5-миллилитровой пробирки, используя один миллилитр связующего буфера. После центрифугирования сточных вод при 300 G в течение пяти минут удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Добавьте один миллилитр раствора PBS BSA и аккуратно перемешайте пипеткой с помощью наконечника пипетки с широким отверстием.
Затем переведите клеточную суспензию в микропробирку объемом 1,5 миллилитра. Опять же, центрифугируйте клеточную суспензию и удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Повторите две стирки одного миллилитра PBS BSA.
После удаления одного миллилитра PBS BSA ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах раствора PBS BSA. Смешайте его пипеткой 10 раз. Определите концентрацию, выполнив анализ трипанового синего, чтобы убедиться, что количество клеток больше или равно 100 000 клеток, и выполните оценку жизнеспособности клеток на основе флуоресценции.
Дополнительный этап сортировки и удаления мертвых клеток после оттаивания позволил получить более чистую клеточную суспензию со значительно более высокой жизнеспособностью клеток и улучшить качество исходного образца. Для большей точности для количественной оценки клеток и ядер использовались два разных метода подсчета, включая трипановый синий и оценку жизнеспособности на основе флуоресценции. В этом протоколе было замечено, что жизнеспособность клеток проходила от 80 до 90% до выделения ядер до менее 5% после выделения ядер.
