Library Capture, Biotin Pull-Down, and PCR Amplification Using Scarce Cell DNA Library

Начните с того, что возьмите от 500 до 1000 нанограммов дефицитной библиотеки клеточной ДНК. Высушите ДНК вакуумным концентратором и ресуспендируйте ее в 3,4 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. После добавления блокаторов и нахождения на термоциклере, при 65 градусах Цельсия перенесите гибридизационный раствор с биотинилированной РНК в заблокированную библиотеку.

Плотно закрыв крышку пробирки, инкубируйте в термоциклере ночь при температуре 65 градусов Цельсия. Затем перенесите 50 микролитров шариков стрептавидина T1 на образец в 1,5-миллилитровую пробирку с низким связыванием ДНК и поместите их на 1,5-миллилитровый магнит-пробирку. Как только все бусины прилипнут к стене, удалите надосадочную жидкость, оставив бусины.

Теперь трижды промойте шарики 200 микролитрами связующего буфера из целевого набора для обогащения и ресуспендируйте шарики в 200 микролитрах связующего буфера. Перенесите образец в ресуспендированные шарики на термоциклере и инкубируйте в течение 30 минут. После промывки шариков 200 микролитрами моющего буфера 1 выдержите их в течение 15 минут, вращая при комнатной температуре.

Затем трижды промыть бусины 200 микролитрами промывочного буфера 2, нагретого до 65 градусов Цельсия и выдержать в термоблоке. Наконец, после амплификации библиотеки с помощью ПЦР выполните очистку ДНК с использованием парамагнитных шариков, добавив 270 микролитров исходных шариков в образец и смешав с помощью вихря. Автоматизированный профиль электрофореза из библиотеки, непосредственно перед захватом, обеспечил 49,7 нанограмма на микролитр ДНК в объеме реакции 20 микролитров.

Тем не менее, 3,06 нанограмма на микролитр ДНК получают из высокочувствительного автоматизированного профиля электрофореза из готовой библиотеки выщелачивания.