Чтобы измерить интенсивность флуоресценции трансфицированных клеток HeLa в программном обеспечении ImageJ, нажмите «Файл» и выберите «Открыть». В диалоговом окне выберите файлы изображений для эксперимента и нажмите кнопку ОК. Когда появится окно параметров импорта биоформатов, выберите разделенные каналы и нажмите «ОК».
В экспериментах с тетраметилродамином, этиловым эфиром, перхлоратом или TMRE YFP является первым каналом, MitoTracker — вторым каналом, а TMRE — третьим каналом. Отрегулируйте яркость, выбрав изображение, затем отрегулируйте, а затем яркость. Затем загрузите сохраненную интересующую область или ROI, нажав «Анализ», затем «Инструменты», затем «Менеджер ROI».
В менеджере ROI нажмите «Еще», затем откройте из списка и выберите сохраненный ROI. Затем измерьте интенсивность флуоресценции пяти случайных областей в одной ячейке, выбрав сохраненную рентабельность инвестиций в диспетчере рентабельности инвестиций и переместив ее в случайное место в ячейке. Чтобы измерить интенсивность флуоресценции, нажмите M на клавиатуре и повторите это с четырьмя дополнительными неперекрывающимися областями.
Когда появится диалоговое окно со значениями области и среднего серого цвета, скопируйте и вставьте значения в электронную таблицу для анализа. Результаты интенсивности флуоресценции TMRE и MitoSOX показали, что их обработка известным развязывающим агентом CCCP снижала интенсивность флуоресценции TMRE по сравнению с контрольными условиями. Кроме того, 20-микромолярная обработка CCCP индуцировала образование супероксида и увеличила интенсивность флуоресценции MitoSOX.
В легких или пятимолярных стрессовых условиях CCCP экспрессия дикого типа Паркина и Parkin T240R приводила к более высокой интенсивности TMRE по сравнению с пустым контрольным вектором YFP. Интенсивность MitoSOX была ниже в клетках, экспрессирующих паркин дикого типа и паркин T240R, по сравнению с клетками, экспрессирующими контрольный вектор YFP, что позволяет предположить, что экспрессия парковки помогает поддерживать здоровье митохондриальной сети, сохраняя более высокие мембранные потенциалы митохондрий и низкие уровни супероксида.
