Чтобы начать количественную оценку показателей окрашенных липидных капель IMAT, откройте Confocal Stacks (Конфокальные стеки) в ImageJ. Откройте пользовательский интерфейс Threshold, выбрав Image, затем Adjust, а затем Threshold. В пользовательском интерфейсе выберите Intermodes в качестве порогового значения и убедитесь, что выбран параметр Dark Background.
Затем нажмите «Применить», чтобы запустить алгоритм пороговых значений. Запустите алгоритм водосбора, чтобы отделить соприкасающиеся капли липидов, выбрав «Обработка», затем «Двоичный» и «Водосбор». Выберите «Да» в диалоговом окне, чтобы обработать все изображения в подборке и добавить тонкую черную линию, разделяющую большие области сплошного белого цвета.
Чтобы задать максимальный и минимальный размер частиц, откройте исходное изображение и обведите самую маленькую и самую большую каплю липида в поле зрения с помощью инструмента «Овал». Затем добавьте эти фигуры в Диспетчер окупаемости инвестиций, введя T.Выберите Анализ, а затем Установить измерения. В диалоговом окне выберите параметры, установите флажок Только область и нажмите кнопку ОК. Затем выберите «Измерить» в диспетчере рентабельности инвестиций.
Используйте две меры площади из этого окна результатов в качестве диапазона размеров и анализируйте частицы. Для определения области интереса, или ROI, с помощью алгоритма анализа частиц. Выберите «Анализ», а затем «Анализ частиц».
Откроется диалоговое окно для настройки параметров выбора. Чтобы вывести измерения ROI, выберите «Анализ», затем «Задать измерения» и выберите «Площадь», «Центроид», «Подогнать эллипс» и «Положение стека». Нажмите кнопку ОК. Затем выберите «Измерить» в диспетчере рентабельности инвестиций.
Данные в таблице результатов можно выбрать и скопировать в Excel для дальнейшего анализа. Для детальной оценки индивидуальных показателей и распределения липидных капель с помощью конфокальной микроскопии были визуализированы флуоресцентно меченные липидные капли BODIPY. Пороговое определение и сегментация по форме обеспечили хороший первый проход для получения ROI для каждой липидной капли.
Однако для исправления ошибок потребовалось ручное редактирование. Глубокие липидные капли, которые казались тусклыми на изображении, можно добавить вручную с помощью инструмента «Овал» в ImageJ. Группу липидных капель, ошибочно идентифицированных как один ROI, также можно исправить, удалив и заменив исходный ROI несколькими новыми ROI.
В тех случаях, когда одна липидная капля была идентифицирована как уникальный ROI в нескольких срезах, повторяющиеся ROI были объединены в один ROI.
