Чтобы инфицировать семядоли сои Agrobacterium rhizogenes, разработайте праймеры для обнаружения гена плазмиды TI virD2 с использованием последовательности Agrobacterium rhizogenes PRI2659 плазмиды. После трансформации протестируйте колонии Agrobacterium на удержание virD2 с помощью ПЦР с помощью набора для ПЦР. После отбора колоний Agrobacterium rhizogenes, содержащих как virD2, так и интересующий ген, поместите несколько колоний на пластины LB, содержащие 100 миллиграммов на литр спектиномицина для интересующей плазмиды.
На следующий день, используя наконечник пипетки P200, соскребите 1,5-сантиметровую длину Agrobacterium с пластины LB и ресуспендируйте ее в одном миллилитре фосфатного буфера. Разбавляют ресуспендированную клеточную суспензию и стерилизуют сверхчистой водой в ацетосирингоне. Измерьте поглощение с помощью кюветной трубки при оптической плотности 600 нанометров.
Далее в шкафу биобезопасности окуните стерилизованный скальпель в раствор «Агробактерии» и сделайте надрез глубиной в один миллиметр по внутренней поверхности семядоли. Поместите шесть-восемь семядолей разрезанной стороной вниз на чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу, насыщенную средой для проращивания и культивации с ацетосирингоном. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение трех дней в течение 16-часового фотопериода.
Через три дня перенесите зараженные семядоли в волосатую корневую поросль, или пластины HRG. Инкубируйте пластины в камерах роста, установленных на 22 градуса Цельсия и интенсивность света 100 микромолей в течение 16-часового фотопериода, пока не будут наблюдаться первичные корни со вторичными корнями длиной два-три сантиметра. Через три-четыре недели заготавливайте первичные корни, которые растут из каллуса и содержат вторичные корни, используя стерильный скальпель и щипцы.
Перенесите корни на отборные пластины HRG, содержащие соответствующие антибиотики, и дайте им расти еще пять дней. На пятый день заготавливайте трансгенные волосатые корни со вторичными корнями длиной от трех до шести сантиметров. При наблюдении за флуоресцентными белками убедитесь, что вторичные корни имеют небольшую автофлуоресценцию.
Затем, чтобы выполнить элиситорную или химическую обработку, разрежьте вторичные корни на кусочки размером в один сантиметр и поместите примерно 100 миллиграммов агара HRG в кучу. Затем насытите кучу 80 микролитрами соответствующего лечебного раствора и дайте тарелке инкубироваться при комнатной температуре. Через 24 часа для экстракции РНК быстро промокните корни сухими на стерилизованном бумажном полотенце и соберите их прямо в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку.
Сразу же запечатайте верхнюю часть трубки с помощью парапленки и сделайте два небольших отверстия с помощью заостренных щипцов. Показаны результаты колонии ПЦР трансформированной Agrobacterium. Положительные колонии в ПЦР указывали на интересующий ген.
Тем не менее, от трети до половины колоний были отрицательными для скрининга гена virD2. Флуоресцентная микроскопия демонстрирует субклеточную локализацию GFP-GmJAZ1-6. Анализ экспрессии генов подтвердил сверхэкспрессию фактора транскрипции глицеоллина GmHSF6-1 и подавление РНКи GmMYB2912 в корнях Williams 82.
