Для начала затравочные HEK293A клетки на глянцевой крышке помещают в 24-луночный планшет, содержащий DMEM с высоким содержанием глюкозы, пока они не станут на 80% сливающимися. На следующий день камеры морили голодом в течение двух часов в сбалансированном растворе соли Эрла. После обработки аспирируют среду и добавляют 500 микролитров или 4%-ный раствор формальдегида в PBS и выдерживают 20 минут при комнатной температуре для фиксации клеток.
После фиксации замените раствор формальдегида на 500 микролитров PBS. Далее гасят свободную альдегидную группу, добавляя 500 микролитров 50 миллимолярного раствора хлорида аммония в PBS на 10 минут при комнатной температуре. Замените раствор хлорида аммония 500 микролитрами 50 микрограмм на миллилитр раствора дигитонина в PBS на пять минут, чтобы проникнуть в клетки.
После пермеабилизации замените раствор дигитонина на 500 микролитров PBS, трижды повторив промывку PBS. После последней промывки инкубируйте клетки в 500 микролитрах блокирующего раствора в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации замените блокирующий раствор на 500 микролитров PBS.
Далее с помощью пинцета соберите покровные листики из лунки и удалите излишки ПБС с помощью тонких тканевых салфеток. В увлажненной камере аккуратно уложите защитный лист клеточной стороной вниз на каплю первичного раствора антитела объемом 50 микролитров. Инкубируйте клетки во влажной камере в течение одного часа при комнатной температуре.
После инкубации соберите покровные листки и слейте излишки первичного раствора антител. Поместите крышки обратно в 24-луночную пластину стороной вверх и промойте их три раза PBS. После последней промывки соберите покровные листы и слейте излишки PBS, прежде чем поместить каждый покровный лист клеточной стороной вниз на каплю вторичного раствора антител объемом 50 микролитров.
Выдерживать во влажной камере в течение одного часа. После инкубации слейте излишки вторичного раствора антител и трижды промойте крышку крышки 500 микролитрами PBS в 24-луночной пластине. После слива излишков PBS поместите каждую защитную крышку клеточной стороной вниз на каплю 50 микролитров раствора крючков, разведенного от одного до 4 000 в PBS в увлажненной камере.
Выдерживать во влажной камере в течение пяти минут. Далее удалите лишний раствор крючков и промойте крышку крышки трижды PBS и один раз деионизированной водой в 24-луночной пластине. После слива лишней деионизированной воды поместите каждую защитную крышку на каплю монтажного раствора объемом от 10 до 20 микролитров, нанесенную на предметное стекло микроскопа, избегая образования пузырьков воздуха.
