Для визуализации конструкций ATG9A в живых клетках семена HEK293A клетки в двух миллилитрах DMEM с высоким содержанием глюкозы в 60-миллиметровую чашку для культуры тканей до тех пор, пока они не достигнут конфлюенции от 65 до 70%. На следующий день приготовьте и добавьте смесь ДНК липофектамина в пластину для клеточной культуры, содержащую четыре миллилитра питательной среды, и осторожно покачивайте пластину вперед и назад, чтобы равномерно распределить смесь. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 10% углекислого газа.
После четырех часов трансфекции замените питательную среду свежей средой и инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 10% углекислым газом. На следующий день трипсинизируйте клетки, добавив трипсин ЭДТА. Затем подсчитайте отделенные клетки и повторно засейте их на чашке для культуры, подходящей для живой микроскопии на ночь.
На следующий день визуализируйте клетки с помощью конфокального микроскопа. В базальных условиях ATG9A в основном локализуется в сети Гольджи, о чем свидетельствует иммунофлуоресценция эндогенного белка, и перекрывается с GM130, цис-маркером Гольджи. eGFP N-терминально меченный ATG9A и mRFP N-терминально меченный ATG9A были менее локализованы в Гольджи и в основном обитали в везикулах.
Напротив, терминально меченный eGFPc ATG9A более склонен к агрегации внутри клетки. Слияние последовательности 3x-FLAG между N-концевым флуорофором и ATG9A помогло сверхэкспрессированному белку вести себя аналогично эндогенному. Сверхэкспрессированный mCherry 3x-FLAG ATG9A колокализуется с маркером Гольджи GM130 в условиях кормления.
Эта локализация и везикулярный компартмент AG9A были сохранены с течением времени, что позволило провести пространственно-временное изучение транспорта ATG9A.
