Начните с отсасывания среды из планшетов, содержащих прилипшее сырье 264,7. Добавьте 10 миллилитров PBS на 15-сантиметровую тарелку. С помощью скребка для клеток отделите клетки и вытяните их в одну 50-миллилитровую трубку.
Пипеткой вгоняйте клеточную суспензию вверх и вниз до гомогенизации. Далее переложите 5% объема клеточной суспензии в новую пробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте при 300G в течение пяти минут при комнатной температуре.
Выбросьте надосадочную жидкость и положите гранулу общей клеточной фракции на лед. После центрифугирования оставшейся суспензии, как описано ранее, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах ледяного митохондриального буфера. Центрифугируйте суспензию при 300G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Повторно суспендируйте гранулу в 0,5 миллилитрах холодного митохондриального буфера. И переложите суспензию в трубку объемом 1,5 миллилитра. Далее гомогенизируйте суспензию, обойдя ее 30 раз через иглу 25 калибра, установленную на одномиллилитровый шприц.
Затем добавьте в пробирку один миллилитр холодного митохондриального буфера и перемешайте методом инверсии. После центрифугирования клеток переложите один миллилитр надосадочной жидкости в свежую пробирку со льдом. Повторно суспендируйте гранулу в буфере и гомогенизируйте гранулу, пропустив ее через иглу 25 калибра, установленную на шприце объемом в один миллилитр.
Соберите гомогенизированные клеточные гранулы и надосадочную жидкость, полученные на предыдущих этапах, в одну пробирку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируйте его при температуре 2000G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость и разделите ее на четыре пробирки по 1,5 миллилитров.
Доведите объем в каждой пробирке до 1,5 миллилитров с помощью митохондриального буфера. Переверните пробирки, чтобы перемешать их содержимое, а затем центрифугируйте пробирки. Аккуратно удалите надосадочную жидкость и верхнюю белую клеточную гранулу.
Держите одну из четырех пробирок, содержащих коричневую митохондриальную гранулу, на льду в качестве сырой митохондриальной фракции. Вытяните оставшиеся гранулы в новую пробирку и сделайте итоговый объем одним миллилитром с митохондриальным буфером. С использованием этого протокола были получены общие клетки и сырые митохондриальные фракции из необработанной клеточной линии 264,7 макрофагов и МПКД.
Иммунологический анализ крови показал, что митохондриальная цитратсинтаза обогащена сырой фракцией. Белки цитозоля, плазматической мембраны, ядра, лизосомы и эндоплазматического ретикулума исчезли. Протеомный анализ показал обогащение сырой фракции более чем в десять раз.
Остальные шесть клеточных компартментов были истощены во время очистки.
