Начните с переноса одной миллилитровой сырой фракции RAW 264,7 митохондрий в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Добавьте 7 миллилитров соленого митохондриального буфера с добавлением 150 миллимоляров натрия хлорида. В суспензию добавьте 50 микролитров шариков TOM22 и затем инкубируйте трубку на вращающемся колесе на низкой скорости.
Поместите колонку на магнит и уравновесьте колонку восемью миллилитрами соленого митохондриального буфера. Откажитесь от проточного потока. После инкубации образца переложите его в колонну и выбросьте проточный.
Далее трижды промойте колонку восемью миллилитрами соленого митохондриального буфера. Снимите колонку с магнита и поместите ее в 15-миллилитровую коническую трубку. Чтобы элюировать митохондрии, добавьте 1,5 миллилитра соленого митохондриального буфера и сразу же нанесите поршень, чтобы вымыть очищенную фракцию в трубку.
Переложите элюированную фракцию в новую 1,5-миллилитровую пробирку и проведите центрифугирование при 21 000G в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Выбросьте образовавшуюся надосадочную жидкость и храните коричневую чистую митохондриальную гранулу при температуре 20 градусов Цельсия для будущих исследований. Иммуноблот-анализ очищенных митохондриальных экстрактов показал обогащение митохондриальной цитратсинтазой и истощение белков из других клеточных органелл.
Исследования целостности митохондрий с помощью электронной микроскопии выявили митохондрии классической овальной формы и неповрежденные кристаллы, окруженные электронно-плотными бусинами, покрытыми антителами. Кроме того, протеомный анализ показал обогащение митохондриальными белками и двумя различными популяциями, соответствующими митохондриальным и немитохондриальным белкам.
