Подтверждение поглощения плазмид с помощью колонийной ПЦР

Перенесите пять микролитров электропорированной ротационной культуры L для ночного роста из 96-луночного планшета в ПЦР-пробирку. Раскрутите ячейки и выбросьте надосадочную жидкость перед тем, как снова суспендировать гранулу в 20 микролитрах 20 миллимолярного гидроксида натрия. Прокипятите образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Вортекс, и повторите кипячение один раз перед тем, как положить образцы на лед. Раскрутите клетки вниз, затем возьмите один микролитр наднатанта и разбавьте в 99 микролитрах ледяной ДНК и РНК свободной двойной дистиллированной воды. Используйте 100-кратное разведение в качестве матричной ДНК в стандартной ПЦР-реакции с использованием плазмидных специфичных праймеров и включите положительный контроль с плазмидой, полученной из мини-препарата E. coli.

После ПЦР поместите образцы на лед и добавьте соответствующий загружающий краситель в концентрации один X. Запустите образцы в 1%-ном желе Agorase в буфере TAE при напряжении 110 вольт в течение 30 минут. Колонийная ПЦР трансформированного L Rotary изменяла температуру приготовления и приводила к различным показателям успешности ПЦР.

Образцы, приготовленные на льду, показали более высокий процент успеха, чем образцы, приготовленные при комнатной температуре или приготовленные при комнатной температуре, а затем инкубированные при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут перед ПЦР.