Чтобы начать вестерн-блоттинг нормализованных переваренных образцов ДНК, добавьте 4-кратный буфер для образцов Laemmli и кипятите образец в течение пяти минут. Загрузите пять-шесть микрограммов переваренного образца в 4-20% полиакриламидный гель и выполните SDS-PAGE для устранения немодифицированных и посттрансляционных модификаций или сопряженных ДПК ФЭУ. Инкубируйте гель с синим пятном Кумасси в течение ночи при комнатной температуре.
Промойте гель двойной дистиллированной водой в течение двух часов перед получением изображения. Для выявления убиквитилирования, модификации SUMO-1 или SUMO-2 и 3, АДФ-рибозилирования, общего TOP1, TOP2 альфа или TOP2 бета DPC разбавляют соответствующие антитела, как показано в таблице. Затем переведите гель в соответствующее разведение первичного антитела в блокирующий буфер и инкубируйте мембраны в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.
После этого инкубируйте промытую PBST мембрану с вторичным антителом, разведенным в 5000 раз в блокирующем буфере в течение 60 минут при комнатной температуре, прежде чем проявлять мембрану с реагентом с усиленной хемилюминесценцией. Получение изображения с помощью системы обработки изображений. Воздействие камптотецина индуцировало образование TOP1 DPC.
Образование TOP1 DPC достигло пика после 20 минут воздействия камптотецина, аналогичного модификации анти-SUMO-2 и 3. Также наблюдалась кульминация модификации и убиквитилирования SUMO-1. ДПК и их модификации SUMO-2 и 3 TOP1 уменьшались в зависимости от дозы камптотекина.
Индуцированные адипоцитами TOP2 DPC и модификация SUMO-2 и 3 достигали пика через 20 минут, а затем снижались. Для сравнения, модификации SUMO-1 и убиквитина достигали пика через 60 минут. Индуцированные формальдегидом ДПК и их SUMO-2 и 3, SUMO-1 и убиквитилирование формировались и накапливались дозозависимым образом.
Количественное обнаружение парилирования TOP1 DPC с использованием анти-PAR антитела, TOP1 DPC PARylation не было обнаружено до тех пор, пока в клетку не был добавлен ингибитор PARG, что позволяет предположить, что PARylation происходит быстро и является высокодинамичным.
