Начните с вырезания не менее 20 семенников из куколок комаров Anopheles в стерильном PBS. Перенесите яички на чистое предметное стекло микроскопа, содержащее свежую каплю PBS. С помощью отфильтрованных наконечников P1000 или кончика иглы для препарирования перенесите яички в чашку для эмбрионов, содержащую 3,7% формальдегида в PBST.
Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. Далее промойте семенники в PBST в течение пяти минут при комнатной температуре. Перенесите яички в чашку для эмбрионов, содержащую РНКазу А, и инкубируйте в течение получаса при температуре 37 градусов Цельсия.
Удалите раствор РНК и добавьте один миллилитр проникающего раствора. Инкубируйте семенники в проникающем растворе при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем промойте яички и PBST два раза по пять минут каждый.
Перенесите яички в пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую от 20 до 30 микролитров гибридизационного раствора с меченым зондом ДНК. Инкубируйте смесь в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в темноте, чтобы обеспечить гибридизацию. С помощью фильтрованного наконечника AP 1000 white bore переложите семенники в чашку для эмбрионов, затем промойте их в двух XSSC в течение пяти минут.
Снимите SSC, затем установите яички на предметное стекло с помощью имеющейся в продаже монтажной среды, содержащей DAPI. Запечатайте предметное стекло защитным герметиком и выдержите его при комнатной температуре в темноте в течение двух часов. Хороший уровень гибридизации позволил визуализировать целевые хромосомы на протяжении всего сперматогенеза.
Спаривание меченых половых хромосом можно было наблюдать на пребиотической и миотической стадиях. Сперматиды, несущие X или Y, можно было проследить на протяжении всего спермиогенеза, отмеченного различными уровнями конденсации ДНК, до финальной стадии стреловидных зрелых сперматозоидов.
