Начните с инокуляции контрольных и рекомбинационных штаммов дрожжей из планшетов YPD в пять миллилитров среды YPR и выращивайте культуру в течение ночи при 30 градусах Цельсия и 200 оборотах в минуту. Затем масштабируйте культуру, введя два миллилитра в 100 миллилитров свежей среды YPR и вырастив ее в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту. Для каждого штамма раздайте 1 800 миллилитров автоклавной дрожжевой пептонной среды и 200 миллилитров автоклавного 20%-ного раствора рафинозы в две 5-литровые колбы Эрленмейера.
Инокулируйте каждый штамм дрожжей с оптической плотностью 0,2 при 600 нанометрах в соответствующей среде и инкубируйте в течение примерно шести часов при 200 об/мин или до тех пор, пока клетки не достигнут желаемой оптической плотности 1,0. Добавьте 200 миллилитров 2%-ной галактозы и 110 микролитров дрожжевого фактора спаривания альфа или YMFA одновременно, чтобы арестовать клетки в фазе G1, и инкубируйте его в течение двух часов. Перелейте клеточную суспензию в литровые ведра центрифуги и центрифугируйте ведро при температуре 6 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 10-15 миллилитрах дистиллированной воды. Затем запечатайте шприц объемом 25 миллилитров пробкой для приманки и поместите его внутрь конической трубки объемом 50 миллилитров, наполненной водой. Перенесите клеточную суспензию в узел шприца.
Вымойте ведра центрифуги пятью миллилитрами дистиллированной воды, чтобы собрать оставшиеся клетки. Затем центрифугируйте сборку при 2, 397 G в течение 10 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Затем извлеките пробку с приманкой из шприца и выдавите клетки в жидкий азот для образования клеточных спагетти.
Наконец, переложите замороженные спагетти в 50-миллилитровую коническую пробирку и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования.
