Начните охлаждение коммерческой кофемолки, измельчив примерно от 30 до 50 граммов сухого льда дважды, каждый раз в течение 30 секунд. Выбросьте порошок сухого льда и смешайте три грамма замороженных спагетти с дрожжевыми клетками примерно с 30-50 граммами сухого льда в предварительно охлажденной кофемолке. Заклейте место соединения между колпачком и кофемолкой парапленкой.
Перемешайте смесь сухого льда дрожжевых клеток 10 раз по 30 секунд каждый, с интервалом в 30 секунд между каждым раундом. Переложите полученный порошок сухого льда дрожжевых клеток в пластиковый стакан, используя чистый и сухой шпатель. После испарения сухого льда добавьте в порошок дрожжевых клеток 2,25 миллилитра магнитного шарика, или буфера MB, с ингибиторами протеазы и фосфатазы.
После энергичного пипетирования клеточной буферной смеси перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую трубку. Затем сохраните 0,1% образцов из сырых клеточных экстрактов для анализа ДНК и 0,05% образцов для анализа белка при температуре минус 20 градусов Цельсия. Переложите оставшуюся клеточную суспензию в двухмиллилитровые реакционные пробирки с низкой связываемостью и отделите клеточный мусор путем центрифугирования пробирок.
Как только это будет сделано, соберите все надосадочные жидкости в одну 15-миллилитровую коническую трубку. Опять же, храните 0,1% надосадочной жидкости при температуре минус 20 градусов Цельсия для ДНК и 0,05% надосадочной жидкости для анализа белка. Затем промойте 500 микролитров суспензии магнитных шариков иммуноглобулина G-связанной с 500 микролитрами холодного буфера MB, содержащего ингибиторы протеазы и фосфатазы, два раза, по пять минут каждый, при четырех градусах Цельсия, при вращении со скоростью 20 об/мин.
Инкубируйте магнитные шарики в 500 микролитрах холодного буфера MB в течение одного часа при четырех градусах Цельсия, вращаясь со скоростью 20 об/мин, прежде чем удалить надосадочную жидкость из шариков с помощью магнитного штатива. Смешайте уравновешенную магнитную суспензию с полученным ранее лизатом клеток и вытянутым в 15-миллилитровую коническую пробирку. После инкубации в течение двух часов при четырех градусах Цельсия и 20 об/мин перенесите полную суспензию лизата магнитных шариковых клеток в реакционные пробирки с низкой связываемостью.
Отделите магнитные шарики, несущие интересующие хроматиновые кольца, от клеточного лизата с помощью магнитного штатива. Переведите оставшийся поток из каждой пробирки в свежую 15-миллилитровую коническую пробирку, прежде чем хранить некоторые образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия для анализа ДНК и белков. Далее суспензируйте магнитный шарик из каждой 15-миллилитровой конической трубки в 300 микролитрах холодного буфера MB и соедините шарики в одну реакционную трубку.
Выполните пять промываний по 10 минут каждое, используя 750 микролитров холодного буфера MB, содержащего ингибиторы протеазы и фосфатазы, при температуре четыре градуса Цельсия, вращаясь со скоростью 20 оборотов в минуту. Далее проведите заключительное промывание 750 микролитрами холодного буфера MB без ингибиторов протеазы и фосфатазы. Подготовленные шарики суспендировать в 40 микролитрах холодного буфера МВ без ингибиторов протеазы и фосфатазы.
