Для начала поместите усыпленную крысу на поверхность вскрытия вентральной стороной вверх. Прищипните слой кожи стерильными щипцами и сделайте надрезы на уровне поверхности, не допуская повреждения внутренних органов. С помощью больших острых ножниц для препарирования сделайте продольный надрез на уровне поверхности в центре живота.
Затем, исходя из этого надреза, сделайте два более коротких горизонтальных надреза, по одному с каждой стороны. С помощью щипцов снимите кожу, чтобы обнажить брюшную полость. Разрежьте перитонеальную оболочку, чтобы полностью обнажить внутренние органы в брюшной полости с готовым доступом к кишечнику.
С помощью ножниц и щипцов найдите живот и определите двенадцатиперстную кишку, расположенную к ней примерно в двух-трех сантиметрах, которая выглядит как желтоватый сегмент. Проксимальный отдел тощей кишки расположен примерно в четырех-пяти сантиметрах дистальнее связки Трейца. Ориентир между двенадцатиперстной кишкой и тощей кишкой.
Поместите изолированный фрагмент кишечника в 10-сантиметровую чашку Петри. Промойте нужный кишечный сегмент брыжейки 10 миллилитрами ледяного PBS до тех пор, пока он не очистится от содержимого просвета. На бумажном полотенце разрежьте кишечный сегмент на кусочки длиной два сантиметра.
Затем вскройте каждый кусочек кишечника в продольном направлении, чтобы обнажить эпителий. Соскребите открытую световую поверхность с помощью предметного стекла под микроскопом, чтобы удалить ворсинки. Поместите кусочки кишечника в раствор ЭДТА на льду и вращайте его на четыре градуса Цельсия в течение 30 минут на трубочном револьвере, настроенном на 10 оборотов в минуту.
В препарирующий микроскоп высыпаем содержимое пробирки в 10-сантиметровую чашку Петри. Добавьте еще пять миллилитров ледяного PBS. С помощью тонких щипцов удерживайте сегмент кишечника и энергично встряхивайте, чтобы наблюдать за выходом эпителия в PBS.
Первоначально PBS будет содержать в основном ворсинки. Постоянно встряхивайте фрагменты кишечника, периодически выбрасывайте ПБС, содержащие ворсинки, и добавляйте к кишечным фрагментам 10 миллилитров свежих ПБС. Продолжайте встряхивать фрагменты и повторяйте этап промывки PBS до тех пор, пока ворсинки не перестанут выделяться в PBS.
Но вместо этого PBS в основном содержит крипты. Оставшиеся фрагменты кишечника отбросить и обогатить оставшиеся ПБС в чашке Петри для кишечных крипт. В колпаке для тканевых культур соберите PBS, содержащий крипты, и отфильтруйте через дренажный аппарат для клеток размером 70 микрон.
Центрифугируйте фильтрат при плотности 250 x g в течение пяти минут. Затем удалите их надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллиметрах усовершенствованного DMEM plus. Снова центрифугируйте при 250 x g в течение пяти минут.
И удалите надосадочную жидкость, оставив 50 микролитров среды вместе с гранулой. Повторно суспендируйте гранулу в оставшейся среде и добавьте ее в аликвоту экстракта внеклеточного матрикса или ЭМЭ на льду. Аккуратно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы равномерно подвешивать крипту по всей EME, избегая образования пузырей.
Поместите 50 микролитров куполов EME в 35-миллиметровую чашку для культуры тканей. Инкубируется при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 20 минут. После инкубации добавьте два миллилитра органоидной среды кишечника крысы, или RIOM, содержащей по 10 микромоляров Y27632 и CHIR99021.
Затем, чтобы пропустить органоиды кишечника крысы, аспирируйте среду из планшета, содержащего органоиды, и добавьте один миллилитр диссоциативного реагента, чтобы освободить органоиды из куполов EME. Перенесите диссоциативный реагент с фрагментированными органоидами в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Промойте культуральную пластину двумя миллилитрами усовершенствованного DMEM plus и добавьте его в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую фрагментированные органоиды.
Используя стеклянную пастбищную пипетку, осторожно делайте пипетки вверх и вниз от 15 до 20 раз, чтобы фрагментировать органоиды. Центрифугируйте органоиды при давлении 350 x g в течение двух минут и добавьте 50 микролитров раствора со дна пробирки в EME. После смешивания раствора поместите 50 микролитров куполов EME в 35-миллиметровую чашку для культуры тканей и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 20 минут.
После инкубации добавьте два миллилитра RIOM, содержащего по 10 микромоляров Y27632 и CHIR99021. Представлены репрезентативные изображения фрагментов ворсинок и склепов. Склепы меньше по размеру по сравнению с ворсинками.
Пластинчатые склепы расширяются в течение следующих нескольких дней и начинают распускаться и дифференцироваться к четвертому-седьмому дням. После двух дней размораживания здоровая органоидная культура показала присутствие как сфероидов, так и отпочковавшихся органоидов. Та же органоидная линия после пассирования показала наличие одиночных криптоподобных доменов.
