Чтобы покрыть пластину EME, разведите EME 1 к 20 в холодном Advanced DMEM+Для покрытия коллагеном, разведите пять миллиграммов на миллилитр коллагена I в Advanced DMEM+до 100 микрограммов на миллилитр. Смажьте пластину 200 микролитрами разбавленного EME или коллагена, чтобы покрыть поверхность лунки полностью, и выдерживайте в течение одного-двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы получить монослои, отсасывайте среду из 35-миллиметровой пластины, содержащей органоиды.
Добавьте один миллилитр PBS и нарушьте EME в лунках с помощью наконечника P1000, пипетируя вверх и вниз примерно 20 раз, чтобы ослабить весь EME. Переложите содержимое в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Добавьте в тарелку один миллилитр PBS, чтобы собрать дополнительные органоиды и перенести их в ту же коническую трубку.
Центрифугируйте образец при 350 G в течение двух минут и удалите надосадочную жидкость, включая остатки ЭМЭ. Затем добавьте один миллилитр раствора трипсина в органоидную гранулу и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут. Сделайте пипетку вверх и вниз 10 раз с помощью наконечника P1000 и добавьте два миллилитра Advanced DMEM+ для нейтрализации трипсина.
Центрифугируйте при 350 G в течение пяти минут и аспирируйте супернант перед тем, как снова суспендировать гранулу в 4,8 миллилитрах rIOM2D. Удалите избыток EME или коллагена в Advanced DMEM+ из лунок. Затем добавьте 200 микролитров органоидов в rIOM2D и 10 микромоляров Y27632 в каждую предварительно покрытую лунку.
Через 4–16 часов соберите среду и центрифугируйте при давлении 1000 G в течение одной минуты. Перелейте надосадочную жидкость в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров и выбросьте гранулу. Промойте каждую лунку 300 микролитрами PBS, прежде чем добавить 200 микролитров центрифугированного rIOM2D в каждую лунку.
Меняйте rIOM2D каждые два-три дня, приостанавливая использование монослоев Y27632.2D, нанесенных на EME, которые легко преобразуются в мелкие сфероиды, когда EME добавляется обратно в верхнюю часть клеток. Напротив, субстрат из коллагена I был недостаточным для реформирования 3D-структур.
