В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра на льду смешайте 10 микролитров бесклеточного экстракта с четырьмя микрограммами плазмидной ДНК и 25 микролитрами 2-кратного буфера для синтеза бесклеточного белка. Сделайте общий объем до 50 микролитров с двойной дистилляцией воды для приготовления раствора для бесклеточного синтеза белка. Взвесьте 0,75 грамма агарозы и добавьте ее в 100 миллилитров дважды дистиллированной воды буфера, чтобы получить 0,75% агарозы.
Разогрейте 0,75%-ную агарозу в микроволновой печи за 30 секунд на высокой мощности и пипетируйте 50 микролитров расплавленной агарозы в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки или в формы желаемой формы. Поместите расплавленную агарозу на нагревательный блок, установленный на 50 градусов Цельсия, и дайте агарозе остыть, но не полимеризоваться. Затем смешайте расплавленную агарозу с раствором для синтеза бесклеточного белка путем пипетирования и перемешивания с помощью наконечника пипетки.
Дайте гелю остыть до комнатной температуры и полимеризуйтесь в течение примерно двух минут. Полимеризованную агарозу переложить в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки с помощью шпателя и мгновенно заморозить в жидком азоте. Поместите мгновенно замороженные гидрогели в хранилище при температуре минус 80 градусов Цельсия на один час.
После этого снимите крышки микроцентрифужных пробирок. Накройте трубки восковой пленкой и проткните пленку, чтобы влага высохла. Установите температуру сублимационной сушилки на отметку минус 20 градусов Цельсия и давление 0,1 миллибар и сублимационную сушку устройств для синтеза бесклеточного белка в течение 18 часов или на ночь.
Регидратируйте лиофилизированные устройства в течение 30 минут 50 микролитрами дважды дистиллированной воды без лишней жидкости и переложите гели на черную 384-луночную микротитровую пластину с помощью шпателя. Наконец, поместите планшет с микротитрованием на планшетный ридер и используйте настройки планшетного ридера, показанные на экране, для обнаружения и анализа флуоресценции. Синтез бесклеточного белка eGFP и mCherry в гидрогеле с использованием лизатов клеток E.coli показан на этом рисунке.
0,75%агарозные гели получали без матрицы ДНК с четырьмя микрограммами либо eGFP, либо mCherry или четырьмя микрограммами как eGFP, так и mCherry. Также показано наложение двух каналов, которое включает в себя дифференциально-интерференционно-контрастное изображение. Результаты подтвердили совместную экспрессию mCherry и eGFP в агарозе.
