Для начала подготовьте оборудование, включив респирометр высокого разрешения и подключив его к программному обеспечению для респирометрии VatLab для сбора и анализа данных. Замените 70% этанол в камере оксиграфа на воду двойной дистилляции. С помощью магнитной мешалки непрерывно помешивайте его со скоростью 750 об/мин в камере.
Дайте ему постоять 10 минут, а затем вдохните воду. Промойте камеру трижды двойной дистиллированной водой по пять минут каждый. Для калибровки датчиков кислорода сначала удалите двойную дистиллированную воду и пипеткой закачайте в камеру два миллилитра среды для клеточной подготовки.
Поставьте пробки так, чтобы образовался пузырь воздухообмена. Чтобы записать значения калибровки кислорода, отрегулируйте такие параметры, как усиление датчика, поляризационное напряжение и интервал записи данных. Затем пометьте эксперимент и введите носитель.
Нажмите на макет и выберите 01 Калибровочный эксперимент GR3 Температура. Перемешивайте среду с помощью мешалки при 750 об/мин в течение не менее 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и контролируйте производительность сенсорной мембраны. Удерживая левую кнопку мыши и клавишу Shift, перетащите мышь, чтобы выбрать область, где изменение концентрации кислорода стабильно.
Затем нажмите на оксиграф, а затем O2 Calibration. При воздушной калибровке измените выбранную метку на выбранную ранее область. Затем нажмите на «Калибровать» и скопируйте в буфер обмена.
Остановите запись и сохраните, нажав на оксиграф. Затем нажмите OK Control, а затем сохраните и отключите. Далее, чтобы провести дыхательную оценку, откройте камеру и втяните внутрь среду.
Загрузите сперматозоиды в конечный объем в два миллилитра MRM для анализа проникающих клеток. Загрузите калибровку, дважды кликнув по окошку калибра POS в нижнем углу и открыв выполненную ранее калибровку. Затем прекратите эксперимент.
Введите 4,5 микролитра 10 миллимолярного дигитонина и проникайте в клетки в течение пяти минут. Записывайте дыхание интактных клеток не менее пяти минут до получения стабильного сигнала. Затем добавьте подложки для комплекса I или комплекса II. Измеряйте потребление кислорода до тех пор, пока сигнал не усилится и не стабилизируется.
Далее вводят пять микролитров 0,5 молярного АДФ и измеряют потребление кислорода до тех пор, пока сигнал не усилится и не стабилизируется. Добавьте в один микролитр четыре миллиграмма на миллилитр олигомицина, который является ингибитором АТФ-синтетазы. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не уменьшится и не стабилизируется.
Титруйте путем добавления одного микролитра FCCP в последовательные этапы, начиная с 0,1 миллимоляра до одного миллимольяра до достижения максимальной скорости несвязанного дыхания. Измеряйте потребление кислорода до тех пор, пока сигнал не усилится и не стабилизируется. Прекратите введение препарата, когда потребление кислорода начнет снижаться.
Наконец, введите один микролитр одного миллимолярного ротенона для комплекса I или пять миллимолярных антимицина А для комплекса II, чтобы различить потребление митохондриального и остаточного кислорода. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не уменьшится и не стабилизируется. Чтобы выполнить анализ данных, выберите области, где поток кислорода на объем коррелирует после инъекции подложки или ингибитора, нажмите на метки, затем на окна статистики и экспортируйте данные.
Нормализуйте данные, полученные на 1 миллион сперматозоидов, и вычтите из всех значений потребление кислорода немитохондриями. Рассчитайте индексы с помощью этих уравнений. Была достигнута успешная регистрация интактных сперматозоидов из образца спермы, где синяя линия показывала концентрацию кислорода, а красная линия представляла поток кислорода на коррелированный объем.
Более низкое количество сперматозоидов приводило к более низкому исходному потреблению кислорода. Кроме того, с помощью этого протокола были получены кривые потребления кислорода конкретно для митохондриального комплекса I или комплекса II.
