Начните с пипетирования одной капли готового к использованию блокирующего раствора с сывороткой ослика на образцы тканей. Затем инкубируйте образцы в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалите излишки блокирующего раствора со слайдов, постучав по краю о твердую поверхность.
Разведите первичные антитела в буфере для разведения антител до приготовления 100 микролитров конечного раствора для каждого образца. Установите антитела, по одной пробирке для каждого первичного антитела и по одной для каждого изоконтролируемого антитела. Равномерно распределите 100 микролитров антител изоконтроля на один образец, а на другой образец – 100 микролитров миелопероксидазы и цитруллинированного гистона Н3, или разведите антитела миелопероксидазы и нейтрофильной эластазы.
Поместите предметные стекла во влажную камеру и храните их в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день сбейте излишки первичного раствора антител со предметных стекол и сложите их в кювету. Промойте предметные стекла три раза в течение пяти минут каждый с использованием трис-буферного физиологического раствора с тином для удаления остатков первичного раствора антител.
Приготовьте два отчетливо флуоресцентных вторичных антитела: donkey anti-goat для миелопероксидазы и donkey anti-rabbit для окрашивания цитруллинированным гистоном H3. Разбавьте каждое антитело до концентрации 7,5 мкг на миллилитр в буфере для разведения антител. Поместите предметные стекла во влажную камеру и нанесите 100 микролитров раствора вторичного антитела на каждый образец.
Выдержите их в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Удалите излишки вторичного раствора антитела, постукивая по предметным стеклам. Поместите слайды в решетку для слайдов.
Погрузите предметные стекла три раза на пять минут каждый в банку для окрашивания, наполненную PBS, чтобы смыть несвязанные антитела. Приготовьте пятнистый раствор и разведите его до концентрации один микрограмм на миллилитр с деионизированной водой. Погрузите решетку для слайдов в банку с раствором для окрашивания и выдерживайте в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте.
Затем погрузите решетку для слайдов в банку для окрашивания PBS на пять минут, чтобы смыть излишки раствора. Наконец, установите образцы с помощью покровных накладок и монтажного носителя. Цитруллинированное антитело гистона H3 связывалось только с внеклеточными гистонами и не показало окрашивания внутриклеточных гистонов.
Специфические антитела к миелопероксидазе человека или мыши не показали специфического окрашивания. В то время как универсальные антитела человека и мыши показали стабильно хорошее окрашивание миелопероксидазы. Когда блокатор не использовался, некоторые образцы мышей показали более неспецифическое и частичное положительное окрашивание.
При блокировке пятиминутное время блокировки показало хорошие результаты по сравнению с 10-минутным временем блокирования. Более высокие температуры в микроволновой печи и водяной бане показали стабильно умеренное или хорошее извлечение антигена. В то время как на водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия было только частичное положительное или отсутствие.
При двойном окрашивании более благоприятные результаты были получены для образцов, инкубированных при температуре 96 градусов Цельсия на водяной бане. Однако превышение времени инкубации в 40 минут при 96 градусах Цельсия приводило к менее интенсивному окрашиванию антител.
