Подготовить образец для перфузионной культуры можно с помощью биореактора, напечатанного на 3D-принтере. В ламинарном шкафу изолированные образцы сонной артерии свиньи помещают в холодную транспортную среду. С помощью лезвия скальпеля удалите лишнюю соединительную ткань и обрежьте концы ткани.
Затем дважды постирайте салфетку в холодном транспортном средстве. Затем поместите ткань в транспортную среду на орбитальный шейкер минимум на 30 минут для тщательной окончательной стирки. После этого соедините неразветвляющийся сегмент промытой артерии с изготовленной системой биореактора с помощью двух колючих соединений приманки.
И закрепите его с помощью сосудистого соединения из сосудистых силиконовых стяжек. С помощью маленького шприца, прикрепленного к первому соединению приманки, аккуратно пропустите средство через артерию, чтобы обеспечить ее проходимость. Закрепив артерию на изготовленном вкладыше, заполните реакционное пространство перфузионной средой.
Затем осторожно заполните контур циркуляции просвета средой, удаляя оставшийся воздух из системы. Наконец, соедините реакционное пространство с собранной перфузионной системой, завершив циркуляцию. Для проведения перфузионной культуры поместите перфузионную систему в инкубатор.
После подключения его к перистальтическому насосу подключите любые дополнительные системы сбора, например, датчики давления. Дайте системе уравновеситься в течение ночи с низким расходом среды примерно от 10 до 15 миллилитров в минуту. На следующий день постепенно увеличивайте расход, пока не будет достигнута конечная скорость потока 35 миллилитров в минуту.
Каждые три дня заменяйте 50% среды, подключая один шприц со свежей средой к порту для обмена средой ближе к насосу, а пустой шприц — к порту ближе к резервуару для сбора отработанной среды. После эксперимента с помощью стерильных хирургических ножниц извлеките ткань из реакционной камеры, обрезав концы тканей, соединенные с биореактором. Конфокальная визуализация с использованием эндотелиальных и гладкомышечных специфических маркеров показала, что нормальная структура артерии хорошо сохраняется и поддерживается на протяжении всей артерии, начиная с момента сбора урожая и заканчивая очисткой и обработкой, и даже после перфузионного посева.
Однако неправильное обращение во время обработки приводило к потере эндотелия до посева, а применение нефизиологических условий культивирования, таких как резкое начало высокого потока, указывало на повреждение просвета. Гистологическая оценка ткани с использованием окрашивания гематоксилином и эозином, а также иммунофлюоресцентного окрашивания во время забора и после семи дней перфузионного культивирования показала, что морфология и общее распределение клеток в стенке сосуда сохранялись на протяжении всего периода.
