Для начала центрифугируйте FBS в течение ночи в ультрацентрифуге при температуре 110 000 G и четырех градусах Цельсия, чтобы удалить эндогенные sEV. Простерилизуйте надосадочную жидкость, отфильтровав ее через ультрафильтрационную мембрану 0,2 микрона, чтобы получить FBS, не содержащий sEVs. Далее в 150-миллиметровую чашку для культур наложите примерно 3 раза по 10 на седьмую увековеченные макрофаги, полученные из костного мозга, в 20 миллилитров питательной среды DMEM.
Инкубируйте чашку при температуре 37 градусов Цельсия под содержанием углекислого газа 5% в течение ночи перед сбором sEV из макрофагов. На следующий день, после отказа от среды, промойте клетки фосфатно-солевым буфером или PBS. Замените среду на DMEM, содержащую 10% свободной фетальной бычьей сыворотки без sEVs, перед инкубацией клеток при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Исходя из требований эксперимента, соберите и перенесите надосадочную жидкость клеток в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте пробирки при 300 G в течение 10 минут, чтобы удалить клетки. Переложите результат в надосадочной жидкости из каждой пробирки в новую 50-миллилитровую центрифугу и выбросьте гранулу.
На этот раз центрифугируйте надосадочную жидкость при 2000 G в течение 10 минут, чтобы удалить мертвые клетки. Затем переложите надосадочную жидкость в новые высокоскоростные центрифужные пробирки и выбросьте гранулы. Далее для удаления мусора и микровезикул центрифугируют полученную надосадочную жидкость при 10 000 G в течение 30 минут с помощью высокоскоростной центрифуги.
Переложите полученную надосадочную жидкость в новые ультрацентрифужные пробирки, добавив по 35 миллилитров в каждую пробирку и выбросив гранулы. Центрифугируйте ультрацентрифужные пробирки в центрифуге с качающимся ротором при 110 000 G в течение 70 минут перед выбросом надосадочной жидкости. Полученную сырую гранулу, обогащенную sEVs, промыть одним миллилитром PBS.
Снова добавьте один миллилитр PBS в промытую гранулу в одной из пробирок и непрерывно перемешивайте пипеткой. Перелейте один миллилитр полученной суспензии PBS в другую пробирку, содержащую гранулы, и повторяйте то же самое до тех пор, пока все гранулы в пробирках не смешаются с помощью пипетирования. Перелейте полученный один миллилитр PBS, богатого sEVs, в новую ультрацентрифужную пробирку.
Затем центрифугируйте новую пробирку в настольной ультрацентрифуге при 110 000 G в течение 70 минут. После удаления надосадочной жидкости промойте полученную сырую гранулу, обогащенную sEVs, 100 микролитрами PBS. Добавьте 1,2 миллилитра раствора для приготовления белка в стандартную белковую пробирку, чтобы растворить присутствующие в ней 30 миллиграммов БСА.
Полученный белковый стандартный раствор разбавить PBS для снижения его концентрации с 25 до 0,5 миллиграмм на миллилитр. Добавьте восемь различных объемов разбавленного белкового стандартного раствора в лунки 96-луночного планшета и доведите объем до 20 микролитров в каждой лунке с помощью ПБД. Добавьте 18 микролитров буфера для лизиса HEPES в лунки для образцов, а затем добавьте два микролитра образцов sEVs.
Далее в каждую лунку добавьте по 200 микролитров рабочего раствора ВСА, приготовленного по инструкции производителя. Дайте тарелке отдохнуть при комнатной температуре от 20 до 30 минут. Наконец, измерьте поглощение на 562 нанометрах с помощью считывателя микропланшетов.
Рассчитайте общее содержание белка в sEVs с использованием полученных результатов. Изображения изолированных sEV, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии, показали типичную чашеобразную морфологию. Анализ отслеживания наночастиц показал, что изолированные sEV были в основном сосредоточены на 136 нанометрах.
Вестерн-блоттинг показал, что изолированные sEVs были значительно обогащены маркерами sEVs, включая CD9, бета-актин и TSG101. Маркер эндоплазматического ретикулята GRP94 был обнаружен только в лизате цельных клеток. Результаты показали, что использованный метод позволил получить sEV с высоким уровнем чистоты.
