Центрифугируйте сателлитные ячейки, изолированные с помощью FACS, и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте клетки одним миллилитром PBS, центрифугируйте и инкубируйте их в одном миллилитре холодного буфера для ядерной экстракции на льду в течение 20 минут. Добавьте 20 микролитров магнитных шариков с покрытием Concanavalin A в 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую 850 микролитров холодного связующего буфера.
Затем с помощью магнитного штатива дважды промойте бусины одним миллилитром холодного связующего буфера и дайте бусинам накопиться на боковой стороне пробирки на штативе в течение пяти минут, прежде чем аккуратно суспендировать их в 300 микролитрах холодного связующего буфера. Затем центрифугируйте ядра и осторожно суспендируйте их в 600 микролитрах буфера для экстракции ядер. Затем смешайте 600 микролитров извлеченных ядер с 300 микролитрами суспензии из гранул Конканавалина А и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут.
После удаления надосадочной жидкости с помощью магнитной стойки ресуспендируйте связанные с шариками ядра с помощью одного миллилитра буфера для блокирования холода. Снова удалите надосадочную жидкость и дважды промойте связанные шариками ядра одним миллилитром холодного буфера для промывки. Отделите надосадочную жидкость, аккуратно ресуспендируйте гранулированные комплексы ядра специфическим первичным антителом и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение ночи с легким перемешиванием.
На следующий день удалите надосадочную жидкость и промойте связанные с шариками ядра перед повторной суспензией в 100 микролитрах холодного буфера для стирки. Добавьте 100 микролитров разбавленной белковой А-микрококковой нуклеазы к 100 микролитрам ядер, связанных с гранулами, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение одного часа с перемешиванием. После инкубации удалите надосадочную жидкость и дважды промойте связанные шариками ядра, прежде чем повторно суспендировать их в 150 микролитрах холодного буфера для промывки.
Далее добавьте три микролитра 100 миллимолярного хлорида кальция, быстро перемешайте и выдержите на льду в течение 30 минут. Остановите реакцию, добавив 150 микролитров стоп-буфера и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Центрифугируйте образцы и перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку, отбросив гранулы и гранулы.
Затем добавьте три микролитра 10% додецилсульфата натрия и 2,5 микролитра 20 мг на миллилитр протеиназы K. Смешайте методом инверсии и выдержите 10 минут при температуре 70 градусов Цельсия. Затем добавьте 300 микролитров фенола:хлороформа:изоамилового спирта и вортекс перед переносом в двухмиллилитровые пробирки фазового замка. Центрифугируйте и добавьте в ту же пробирку 300 микролитров хлороформа.
Снова центрифугируйте и соберите надосадочную жидкость в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте один микролитр гликогена, затем 750 микролитров 100% этанола и дайте ДНК осадиться в течение ночи при температуре минус 20 градусов по Цельсию. На следующий день гранулируйте ДНК методом центрифугирования, затем промойте гранулу одним миллилитром 100% этанола и дважды центрифугируйте перед удалением остатков этанола с помощью пипетки.
Высушите гранулу на воздухе в течение пяти минут и снова суспендируйте в 25 микролитрах буфера трис-ЭДТА. H3KME2 и H3K27AC были обогащены вокруг TSS PAC7, ITGA7, LAM2, CXCR4 и VCAM1. Тем не менее, H3K4ME2 и H3K27AC не обогатились за счет ITGAM, PTPRC, PECAM, CKM или MHY3.
С образцом IgG сигнал практически не был получен. Показаны известные мотивы анализа АР и сателлитных ячеек ГОМЕРа, а также процент целевых областей. Анализ искателей выявил почти 500 пиков с пиковой оценкой выше 50, причем более 200 из них с оценкой выше 100.
