Начните с центрифугирования изолированной суспензии клеток мозга при 300G в течение восьми минут. Суспендируйте гранулу в 80 микролитрах HBSS с 0,5% раствором BSA. Добавьте 20 микролитров коктейля антител к биотину ненейрональных клеток и инкубируйте.
Промойте клетки двумя миллилитрами HBSS с 0,5% BSA. Затем повторно суспендируйте гранулу центрифуги в 80 микролитрах HBSS с 0,5% BSA. Теперь добавьте 20 микролитров микрогранул антибиотина, и пипеткой тщательно перемешайте.
После холодной инкубации добавьте 0,5 миллилитра раствора HBSS BSA. Установите подставку перед промывкой колонки 0,5 миллилитрами HBSS с 0,5% BSA. Далее поместите под колонку 15 миллилитровую трубку и пропустите через нее 0,5 миллилитра клеточной суспензии.
Проведите три полоскания с 0,5 мл HBSS с 0,5% раствором BSA для захвата остаточных нейронных клеток. Снимите колонку с магнита и поместите ее внутрь новой 15-миллилитровой трубки. Добавьте один миллилитр HBSS с 0,5% BSA и используйте поршень для сбора магнитно помеченных ненейрональных клеток.
После центрифугирования клеток повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре HBSS с 0,5% раствором BSA. Подсчитайте клетки на счетной камере Нейбауэра под светлопольным микроскопом. ЛепР-позитивные нейроны начали образовывать нейриты через 48 часов.
При DIV4 аксональные расширения показали прогресс, в то время как начали появляться дендритные процессы. В DIV6 нейроны были достаточно развиты. Иммунофлуоресцентные исследования показали, что глиальных клеток или других ненейрональных клеток не наблюдалось.
Нейрональная природа клеток была подтверждена окрашиванием микротрубочек, ассоциированных со вторым белком. При DIV10 30% LepR-положительных клеток экспрессировали POMC. Синаптические связи и функциональность наблюдались в общих культурах, содержащих гетерогенные популяции нейронов гипоталамуса.
