Начните с центрифугирования чистой суспензии нейрональных клеток при 300 G в течение восьми минут. Аккуратно отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 80 микролитрах HBSS с 0,5 раствором BSA. После добавления специфического антитела инкубируйте пробирки при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут.
Промойте излишки антител раствором HBSS-BSA и центрифугой. Добавьте в гранулу 20 микролитров микрогранул антибиотина, ресуспендированных в HBSS-BSA. Инкубируйте трубку при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут.
Затем добавьте 0,5 миллилитра HBSS с 0,5% раствором BSA на каждые 10 до семи клеток. Промойте колонку 0,5 миллилитрами HBSS с 0,5%-ным раствором БСА. Как только капание прекратится, поместите под колонку 15-миллилитровую трубку и пропустите через нее 0,5 миллилитра клеточной суспензии.
Соберите элюат, содержащий неспецифические нейрональные клетки, затем очистите колонку тремя промывками 0,5 мл HBSS с 0,5% BSA. Теперь снимите колонку с магнита и поместите ее в новую 15-миллилитровую трубку. Добавьте один миллилитр HBSS с 0,5% BSA и используйте поршень для промывания целевых клеток.
После центрифугирования и надосадочной аспирации повторно суспендировать гранулу в 0,5 миллилитрах гальванической среды. Подсчитайте клетки в счетной камере Нейбауэра под светлопольным микроскопом. В подготовленном 24-луночном планшете тарелируют целевые клетки в качестве положительного контроля и неспецифические клетки в качестве отрицательного контроля.
Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12 часов. LepR-позитивные нейроны начали образовывать нейриты через 48 часов. В DIV4 аксональные расширения показали прогресс, в то время как начали появляться дендритные процессы.
В DIV6 нейроны были достаточно развиты. Иммунофлуоресцентные исследования показали, что глиальных клеток или других ненейрональных клеток не наблюдалось. Нейрональная природа клеток была подтверждена окрашиванием микротрубочек-ассоциированным белком 2.
В DIV10 30% LepR-положительных клеток экспрессировали POMC. Синаптические связи и функциональность наблюдались в общих культурах, содержащих гетерогенные популяции гипоталмических нейронов.
