Измерение размера пор и анализ распределения клеток децеллюляризованных скаффолдов, полученных из яблок, с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

Для начала промойте децеллюляризованные яблочные каркасы фосфатным солевым буфером. Для измерения размера пор инкубируйте скаффолды в одном миллилитре 10%-ного раствора калькофтора белого белка в течение 25 минут в темноте при комнатной температуре. После промывки скаффолдов с помощью PBS используйте высокоскоростной резонансный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп и установите конфигурацию лазерно-эмиссионного фильтра.

Отрегулируйте мощность лазера и детектор вручную, чтобы обеспечить оптимальное получение изображения. Получите Z-стек из 20 изображений с шагом пять микрометров. Затем в программном обеспечении ImageJ используйте функцию Z project to maximum intensity для создания изображения и примените функцию поиска краев, чтобы выделить край пор.

Обведите поры вручную с помощью инструмента произвольного выделения. Подгоните каждую пору в виде эллипса и измерьте длину большой оси. Соберите все замеры и рассчитайте среднюю длину.

Для анализа распределения клеток после трехкратной промывки культивируемых в соответствующей среде клеточных каркасов ПБС фиксируют их 4%-ным параформальдегидом в течение 10 минут. Затем тщательно промойте каждый каркас деионизированной водой, пропитайте ячейки раствором Triton X-100 в течение пяти минут и снова промойте PBS. Выдерживают скаффолды в одном миллилитре 1%-ной периодической кислоты в течение 40 минут и промывают деионизированной водой.

Затем инкубируют скаффолды, полностью погружая их в один миллилитр красящего раствора. Промойте скаффолды PBS и окрасьте клеточные ядра, инкубируя каркасы в растворе DAPI с концентрацией пять миллиграммов на миллилитр в течение 10 минут в темноте. Еще раз тщательно вымойте и храните строительные леса в ПБС.

Визуализируйте клеточные каркасы с помощью высокоскоростного резонансного конфокального лазерного сканирующего микроскопа при 10-кратном увеличении, используя настройки, показанные здесь. Отрегулируйте мощность лазера и детектор вручную, чтобы обеспечить оптимальное получение изображения, и получите Z-стек из 20 изображений с шагом в пять микрометров. Затем используйте программное обеспечение ImageJ для обработки конфокальных изображений и используйте функцию Z для максимальной интенсивности, чтобы создать максимальную проекцию по оси Z для анализа изображений.

Количественная оценка изображений конфокальной микроскопии показала распределение пор по размерам от 73 до 288 микрометров, в среднем около 154 микрометров. Большинство пор имели размер от 100 до 200 микрометров. После культивирования в дифференцировочной среде в строительных лесах наблюдались залежи минералов.

Каркасы, засеянные клетками, имели непрозрачную белую окраску, предполагающую минерализацию, которая не наблюдалась в пустых каркасах. Кроме того, анализ конфокальной лазерной сканирующей микроскопии выявил однородное распределение клеток внутри скаффолдов.