Активность щелочной фосфатазы, отложение кальция и измерения модуля Юнга в децеллюляризованных скаффолдах, полученных из яблок

Для анализа щелочной фосфатазы и осаждения кальция начните с промывки клеточных семян, полученных из яблок, каркасов, культивируемых в соответствующей среде три раза PBS. Закрепите каркасы 10%-ным нейтральным буферным формалином на 30 минут. Для анализа на щелочную фосфатазу приготовьте раствор для окрашивания BCIP/NBT, растворив одну таблетку BCIP/NBT в 10 миллилитрах деионизированной воды.

Затем вымойте неподвижные каркасы 0,05%-ным раствором TWEEN и покрасьте раствором BCIP/NBT в течение 20 минут при комнатной температуре. Вымойте пятна 0,05%-ным раствором TWEEN и храните их в PBS. Затем сфотографируйте окрашенные леса с помощью 12-мегапиксельной цифровой камеры.

Для анализа осаждения кальция приготовьте 2% массовый раствор для окрашивания Alizarin Red S. Затем промойте неподвижные каркасы деионизированной водой и окрасьте их раствором Alizarin Red S в течение одного часа при комнатной температуре. Промойте окрашенные каркасы деионизированной водой и поместите их в PBS перед визуализацией.

Снимок на 12-мегапиксельную цифровую камеру. Чтобы выполнить измерения модуля упругости по методу Юнга, извлеките каркасы из соответствующей инкубационной среды и немедленно испытайте образцы с помощью специально изготовленного одноосного компрессионного аппарата, оснащенного тензодатчиком 1,5 ньютона. Сожмите строительные леса с постоянной скоростью три миллиметра в минуту до максимальной сжимающей нагрузки 10% от высоты лесов.

Определите модуль Юнга по наклону линейной части кривых напряжения/деформации. Окрашивание BCIP/NBT выявило существенное увеличение активности щелочной фосфатазы в клеточных каркасах, культивируемых в дифференцировочной среде, по сравнению с пустыми или недифференцированными культуральными каркасами. Аналогичные результаты были получены при окрашивании Alizarin Red S, что указывает на большую минерализацию кальция в клеточных каркасах, культивируемых в дифференцировочной среде.

Модуль Юнга клеточных каркасов, культивируемых в дифференцировочной среде, составлял около 192,0 кОпаскаля, что было значительно выше, чем у пустых или недифференцированных культуральных каркасов, что указывает на более высокую жесткость.