Генерация субмитохондриальных везикул из митохондрий Saccharomyces cerevisiae для выделения мест контакта с митохондриями

Для начала возьмите 10 миллиграммов свежевыделенных неочищенных митохондрий сырых дрожжей и повторно суспендируйте их в 1,6 миллилитрах буфера SM при четырех градусах Цельсия с помощью пипетирования. Затем перенесите митохондриальную суспензию в предварительно охлажденную 100-миллилитровую колбу Эрленмейера. Медленно добавьте 16 миллилитров буфера для набухания, используя стеклянную пипетку объемом 20 миллилитров, применяя при этом постоянное легкое помешивание льда.

Инкубируйте образцы при постоянном слабом помешивании в течение 30 минут на льду. Затем медленно добавьте пять миллилитров 2,5-молярного раствора сахарозы с помощью пятимиллилитровой стеклянной пипетки, позволяя внутренней мембране уменьшиться. Инкубируйте образцы при слабом помешивании в течение 15 минут на льду.

Чтобы создать везикулы субмитохондриальной мембраны, перенесите митохондриальную суспензию в предварительно охлаждаемую розетку и обрабатывайте суспензию ультразвуком с амплитудой 10% в течение 30 секунд, охлаждая розетку на ледяной бане. Дайте суспензии отдохнуть в течение 30 секунд в ледяной бане.