Начните с растворения 0,0005 грамма НБТ в 10 микролитрах ДМСО. После вихревания в течение 15 минут добавьте 90 микролитров сбалансированного солевого раствора Хэнка или HBSS с кальцием и магнием и один микролитр исследуемых веществ. Снова встряхните трубку до двух минут.
Для проведения НБТ-теста на предметное стекло осторожно перемешать и перенести два микролитра ранее подготовленных активированных полиморфноядерных нейтрофилов на чистое предметное стекло. Инкубируйте предметное стекло в увлажненной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Далее добавляют один микролитр рабочего раствора НБТ на клетки.
Снова выдерживают в течение 20 минут, защищая от света. После высыхания предметного стекла зафиксируйте его, нанеся по капле метанола в каждую лунку на одну минуту. Окрасьте предметное стекло 0,03 сафранина еще на одну минуту.
В каждой лунке насчитать 100 случайных клеток, дифференцирующих нейтрофилы с формазановыми отложениями и без них. Для проведения спектрофотометрического анализа НБТ аккуратно перемешать и перенести 90 микролитров предварительно подготовленных активированных полиморфноядерных нейтрофилов в чистую микроцентрифужную пробирку. Затем осторожно добавьте 20 микролитров шестимиллимолярного раствора NBT и инкубируйте пробирку в темноте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.
После инкубации добавьте 100 микролитров 10%-ного SDS и Vortex. Ультразвуковая обработка с помощью наконечника с амплитудой 60%, добавляя пять циклов по 15 секунд каждый и 15-секундные интервалы. Центрифуга при 12 000 г в течение пяти минут.
Перенесите 60 микролитров надосадочной жидкости на прозрачную нижнюю 96-луночную пластину и измерьте абсорбцию надосадочного продукта на длине волны 570 нанометров. Результаты спектрофотометрического анализа показали, что 100 наномолярных ПМА индуцировали повышенную продукцию АФК по сравнению с fMLP и контрольной группами. Результаты теста предметного стекла NBT подтвердили результаты спектрофотометрических результатов, показав, что PMA является наиболее интенсивным стимулом, индуцирующим продукцию АФК, по сравнению с fMLP.
