Для начала зафиксируйте конечности мыши, находящейся под наркозом, с помощью скотча. Держите кожу живота вверх и аккуратно разрежьте по окружности грудной клетки, чтобы полностью обнажить ее. Офтальмологическими ножницами сделайте небольшой надрез в правом предсердии и сразу же введите иглу перфузии 22 калибра в верхушку левого желудочка.
Затем протолкните через шприц от 30 до 50 миллилитров сердечной перфузионной жидкости. После того как отток жидкости из правого предсердия станет полностью прозрачным, влейте в равный объем 4% раствор ПФА. Рассеките ткани и органы и зафиксируйте их на ночь с помощью 4% PFA при четырех градусах Цельсия.
Для индуцирования декальцинации тканей. поместите неподвижную сердечную ткань в 10 миллилитрах раствора ЭДТА на встряхивающий стол при температуре 37 градусов Цельсия. Инкубируйте около двух дней и меняйте жидкость ежедневно.
Поместите неподвижные кости кальварии в 20 миллилитров 25% раствора квадрола для обесцвечивания тканей. Инкубируйте на встряхивающем столе при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного дня и смените жидкость один раз. Затем последовательно поместите ткань в 30% раствор третичного бутанола или туберкулеза.
Затем раствор 50% ТБ, а затем раствор 70% ТБ для выполнения градиентного обезжиривания. Затем обезвоживайте образцы и раствор TB PEG в течение шести часов на встряхивающем столе при температуре 37 градусов Цельсия. Наконец, поместите полностью обезвоженную ткань в раствор BB PEG на стол для встряхивания при температуре 37 градусов Цельсия.
После двух-четырех часов инкубации ткань станет прозрачной. Метод очищения тканей PEGASOS привел к получению прозрачной ткани. Очищенная ткань с окрашиванием EDU показала, что мечение было эффективным и хорошо сохранилось.
В контрольной группе несколько EDU-положительных клеток были диффузно распределены по швам. После одного дня расширения шва наблюдались пролиферирующие клетки в середине и по краям шва. По мере расширения шва количество пролиферирующих клеток со временем уменьшалось.
Зеленые меченые клетки представляли собой небольшие круглые клетки в костном мозге, которые отличались от EDU-положительных шовных клеток.
