Чтобы начать подготовку сеток электронной микроскопии для клеточной криотомографии, поместите сетку, загруженную перфорированной углеродной вспомогательной пленкой, в устройство для тлеющего разряда угольной стороной сетки вверх. Затем разряжайте решетку при давлении 15 миллиампер при атмосферном давлении 0,39 миллибар в течение 45 секунд. Как только это будет сделано, поместите сетку в чистую емкость, застеленную фильтровальной бумагой.
Затем перенесите сетку вместе с фибронектином, фосфатно-солевым буфером или PBS, пластинами и пинцетом в шкаф биобезопасности. С помощью микропипетки нанесите две большие точки бычьего фибронектина на стерильную поверхность, например, на крышку шестилуночной пластины. Убедитесь, что точки достаточно большие, чтобы охватить всю сетку.
Затем приобретите пинцет пять на 15 и обработайте обе стороны сетки раствором для прилипания фибронектина. После обработки фибронектином крупного рогатого скота сетка станет липкой. Осторожно коснитесь неуглеродистой поверхности сетки на дне пустого отверстия в шестилуночной пластине и отпустите пинцет, чтобы прикрепить сетку к новой поверхности.
Далее инкубируйте сетку в течение 30 минут в растворе для прилипания фибронектина. Чтобы предотвратить высыхание решеток, добавляйте одну-две капли адгезивного раствора поверх решеток с помощью микропипетки каждые 15 минут. После инкубации удалите излишки адгезивного раствора с помощью микропипетки.
Промойте решетки, добавив капли PBS непосредственно на решетки, используя микропипетку два-три раза. Стерилизуйте решетки под ультрафиолетовым излучением в шкафу биобезопасности в течение одного часа. Расположите решетки как можно ближе к ультрафиолетовому излучению для максимальной стерилизации.
Предотвратите высыхание решеток во время стерилизации с помощью микропипетирования одной-двух капель PBS поверх сетки каждые 10 минут.
