Перед погружением в замораживание сеток электронной микроскопии, содержащих клетки, осмотрите сетки под перевернутым оптическим микроскопом. Запишите плотность ячеек на каждой сетке, чтобы скорректировать время промокания во время погружной заморозки. Нагрейте два-три миллилитра фосфатного буферного раствора или PBS в пустой тарелке при температуре 37 градусов Цельсия.
Для приготовления реперных баллов по золоту пипеткой 50 микролитров 10-нанометрового раствора коллоидных золотых шариков в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте к нему два микролитра бычьего сывороточного альбумина и гомогенизируйте путем микропипетирования неоднократно. Центрифугируйте пробирку при температуре от 15 000 до 20 000 G в течение 15 минут.
Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу с помощью микропипетки. Повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах PBS и снова центрифугируйте пробирку, как было продемонстрировано ранее. Отсадите четыре микролитра гранулы с помощью наконечника объемом 10 микролитров и переложите его в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра.
Установите климатическую камеру при влажности 95% и температуре 30 градусов Цельсия. С помощью пинцета пять на 15 выберите сетку и промойте ее PBS. Переложите промытую сетку на погружающийся пинцет.
Как только сетка будет закреплена, снимите пинцет пять на 15 и наденьте зажим на погружающийся пинцет. Вставьте решетку в морозильную камеру, надежно удерживая зажим. Добавьте один микролитр золотых реперных знаков на обратную сторону сетки.
Затем добавьте два-три микролитра PBS на угольную сторону решетки. Используйте автоматическую промокательную обработку для промокания обратной стороны сетки перед погружением в замораживание в жидкий этан. Изображение трансфицированных клеток U2OS, полученное с помощью криокоррелятивного света и электронной микроскопии, показало наличие клеток, продуцирующих ВИЧ.
Изображение электронной криотомографии показало множественные частицы ВИЧ, отпочковывающиеся от плазматической мембраны клеток U2OS.
