Для начала, в нулевой день, предварительно подогрейте безсывороточную дифференцировочную среду или среду SFD, содержащую 1 цитокин до 37 градусов Цельсия. Затем, под стерильным тканевым культуральным колпаком, добавьте среду, обогащенную цитокином, Mix 1 в каждую лунку шестилуночного планшета для репеллента. Чтобы получить клетки, аспирируйте питательную среду из шестилуночного планшета, содержащего индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки или человеческие IPS-клетки.
Промойте их с помощью DPBS с последующей аспирацией DPBS. Затем добавьте в клетки диссоциационный реагент и инкубируйте их при комнатной температуре в течение минуты. После аспирации этого диссоциационного реагента инкубируйте клетки еще три минуты при комнатной температуре.
Затем коснитесь пластины, содержащей клетки, 10 раз с каждой стороны, чтобы отделить кластеры клеток. Добавьте один миллилитр предварительно подогретой среды Mix 1 с добавлением цитокина SFD в клетки на лунку. С помощью пастбищной пипетки перенесите кластеры клеток из каждой лунки в одну лунку клеточной репеллентной пластины, содержащей среду с цитокином Mix 1.
После введения тарелки в инкубатор перемещайте ее вперед и назад, а также из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить содержимое и инкубировать его для формирования эмбриоидных тел, или БЭ. На следующий день поверните пластину с репеллентами, содержащую БЭ, чтобы собрать их в центре лунок. С помощью пастеровской пипетки перенесите суспензию EB из лунок в 15-миллилитровую центрифужную пробирку.
Подождите пять-10 минут, пока БЭ осядут на дне трубки. Тем временем промойте отталкивающие пластины стерильной водой или DPBS, чтобы удалить отдельные клетки или мусор. Добавьте два миллилитра Mix 1 с добавлением цитокина SFD в каждую лунку пластины.
Теперь аккуратно отсасывайте надосадочную жидкость из центрифужной пробирки, не смещая БЭ. Ресуспендируйте БЭ в расчетном объеме среды SFD, содержащей цитокин Mix 1. Добавьте по одному миллилитру суспензии EB в каждую лунку промытой клеточной отталкивающей пластины, уже содержащей два миллилитра среды.
Инкубируйте планшет после диспергирования EB, осторожно перемещая планшет, как упоминалось ранее. После сбора EB в центре лунок, добавьте хирон сбоку от каждой лунки, избегая прямого контакта с клетками, инкубируйте лунки, как было показано ранее. В третий и шестой дни дифференцировки соберите EB и выполните смену среды, как было показано ранее в первый день.
Используйте среду SFD с добавлением цитокинов Mix 3 на третий день и используйте среду SFD с добавлением цитокинов Mix 4 на шестой день. После сбора и осаждения БЭ из клеточного репеллентного планшета в 15-миллилитровую центрифужную пробирку, как было показано ранее, аспирируйте надосадочную жидкость, затем добавьте один миллилитр реагента для диссоциации клеток в каждую лунку БЭ, собранную в пробирке, чтобы ресуспендировать БЭ. Далее перелейте по одному миллилитру этой суспензии в каждую лунку ячейки репеллентной пластины, промытой водой.
После 10-минутной инкубации планшета в инкубаторе с помощью пипетки P1000 диссоциируйте БЭ в каждой лунке, осторожно пипетируя вверх и вниз не более 10 раз. Затем добавьте пять миллилитров промывочного буфера на лунку диссоциированных БЭ. Соберите клетки в 50-миллилитровую центрифужную пробирку, пропустив их через 40-микронное ситечко.
После подсчета клеток в отфильтрованной суспензии раскрутите клетки в течение 10 минут при 300 г. Восстановите суспендию клеток в 300 микролитрах промывочного буфера, осторожно проведя пипетирование несколько раз, убедившись, что в них нет комков. Приступайте к выделению CD34-положительных клеток с помощью набора микрогранул CD34 в соответствии с инструкциями производителя.
БЭ хорошего качества показали четкую границу ко второму дню дифференцировки и казались четкими и яркими при наблюдении под микроскопом. Наличие более темных участков указывало на гибель клеток внутри БЭ. После обработки хироном в различных концентрациях на второй день количественная оценка количества CD34-положительных клеток на восьмой день дифференцировки показала реакцию клеточной линии на лечение.
Проточная цитометрия показала, что CD34-положительное обогащение с помощью магнитных шариков обеспечивает около 85% CD34-положительных клеток.
